甲氧化三丁基錫多終點遺傳毒性評價和誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、有機錫(Organotin)可強烈地殺滅真菌、蟲體以及軟體動物，自20世紀60年代開始作為涂料添加劑廣泛用于防止海洋附著生物對船體、魚網(wǎng)、鉆井平臺等的污損。三丁基錫(Tributyltin，TBT)是其中應(yīng)用最多、效果最強的一類。然而由于其不斷釋放入周圍水體并沉降入海泥中，對其它非目標性生物也產(chǎn)生了嚴重的生態(tài)環(huán)境危害。三丁基錫還是一種內(nèi)分泌干擾物，可導(dǎo)致貝類畸形、牡蠣發(fā)育異常、腹足類動物性畸變(Imposex)。三丁基錫不僅對水生生物造

2、成危害，而且可以通過食物鏈危害人類。有機錫對海洋的污染及其對海洋生物的毒性受到各國的關(guān)注，并被認為是迄今為止由人為因素而導(dǎo)致大量進入海水環(huán)境的毒性最大的化學(xué)品之一，許多國家政府紛紛采取措施限制和禁止有機錫在海洋中的使用，目前已被聯(lián)合國環(huán)境保護署歸入持久性有毒物質(zhì)(Persistenttoxicsubstances，PTS)之一，國際海事組織已經(jīng)規(guī)定2008年后停止使用。盡管人們可以減少三丁基錫從涂料中的釋放量，但是三丁基錫能夠在海泥中高

3、濃度地保留許多年，尤其是在一些海灣地區(qū)。 對三丁基錫的研究報道多是關(guān)于免疫毒性和內(nèi)分泌干擾作用的研究，對三丁基錫的遺傳毒性以及毒作用機制的研究報道很少，而且多是關(guān)于水生生物。有研究者以貽貝(Mytilusedulis)和沙蟲(Platynereisdumerilli)兩種腹足軟體動物為實驗材料對三丁基錫進行了姐妹染色體交換試驗、染色體畸變試驗、彗星電泳試驗及微核試驗，發(fā)現(xiàn)其具有遺傳毒性，但誘導(dǎo)遺傳毒性的劑量與存活率的劑量非常接近

4、，因此亟待采用其它種類的生物進行遺傳毒性的研究。 每種遺傳毒性評價試驗都能反映特定的遺傳學(xué)終點。但任何試驗都不能反映全部的遺傳學(xué)終點，因此，對化合物的遺傳毒性評價需要進行試驗配套，即采用遺傳學(xué)終點相互互補的試驗進行聯(lián)合評價和研究。在配套試驗中，應(yīng)包括體內(nèi)試驗(invivo)和體外試驗(invitro)、真核細胞試驗和原核細胞試驗。因此，為對三丁基錫進行較系統(tǒng)的遺傳毒性評價，本研究以甲氧化三丁基錫(Tributyltin，TBTM

5、O)為對象、采用了包括哺乳動物在內(nèi)的、多遺傳學(xué)終點的配套試驗對三丁基錫的遺傳毒性進行了評價，內(nèi)容包括：小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)、小鼠脾淋巴細胞hprt基因突變試驗、CHL細胞染色體畸變試驗，并對急性毒性進行了實驗研究。 細胞凋亡也稱細胞程序性死亡(Programmedcelldeath，PCD)，是細胞內(nèi)或細胞外的誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)的一種細胞主動“自殺”過程，也是化合

6、物發(fā)揮細胞毒性的重要分子機制。有研究表明，三丁基錫對細胞和生物體均表現(xiàn)出強烈的毒性，并可誘導(dǎo)細胞凋亡。然而，凋亡過程中涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和效應(yīng)蛋白，并具有嚴格的時序控制性。不同的凋亡誘導(dǎo)因子可以通過不同的途徑和機制誘導(dǎo)細胞凋亡。至今三丁基錫誘導(dǎo)凋亡的機制仍未完全確定。為此，本研究以人Jurkat淋巴瘤細胞為實驗材料，對甲氧化三丁基錫誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)、第二信號因子胞內(nèi)鈣離子的變化、是否通過線粒體途徑(檢測線粒體膜蛋白Apo2.

7、7、線粒體膜電位(△ψm))、是否依賴于凋亡的重要效應(yīng)器caspase-3和核DNA修復(fù)機制相關(guān)的PARP酶、細胞DNA斷裂分析、對細胞周期的影響、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的細胞周期時相等多個凋亡通路節(jié)點和相關(guān)因子進行了研究。 小鼠淋巴細胞hprt基因突變分析試驗是遺傳毒性評價的重要方法，其獨特的優(yōu)點在于不僅能檢測出突變劑的致突變能力大小，還可以進一步檢測其分子突變譜。然而該試驗是在96孔U型細胞培養(yǎng)板中完成，實驗中需要在顯微鏡下觀察和記錄

8、細胞克隆，但是非染色狀態(tài)下細胞克隆在U型板中不易辨別。顯微鏡下人工判定是一項繁重而準確性欠佳的工作。 近年來，轉(zhuǎn)基因動物在環(huán)境致突變研究方面得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用。究其原因，是因為轉(zhuǎn)基因動物結(jié)合了目前體內(nèi)外遺傳毒理試驗的主要優(yōu)點。它既有一個明確的外源靶基因便于在動物染毒后可從任一感興趣的特定靶器官或組織中分離和回收靶基因，并在體外進行精確的分子突變譜分析(體外試驗的優(yōu)點)；同時，它又可以整體動物染毒，能比較真實地反映誘變劑在體內(nèi)的

9、吸收、分布和代謝方面的特點(體內(nèi)試驗的優(yōu)點)，因此，轉(zhuǎn)基因動物是目前研究體內(nèi)基因突變比較理想而且有效的工具。 GFP基因近年來廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)，其表達產(chǎn)物GFP不需其它熒光素的標記即可發(fā)射綠色熒光。理論上GFP轉(zhuǎn)基因動物用于hprt基因突變試驗正好可以解決試驗中細胞克隆不易觀察的技術(shù)問題，是hprt突變試驗的理想動物模型。為了更好地應(yīng)用小鼠hprt突變試驗對三丁基錫進行遺傳毒性評價，本文對GFP轉(zhuǎn)基因小鼠用作hprt基因突變

10、試驗動物模型進行了初步研究。 本研究共包括三個部分。主要結(jié)果如下： 第一部分：GFP轉(zhuǎn)基因小鼠用作hprt基因突變試驗動物模型的初步研究。 1.比較了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和普通小鼠的微孔培養(yǎng)物在顯微鏡下的觀察結(jié)果。結(jié)果顯示GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的微孔培養(yǎng)物比普通小鼠易于確認，結(jié)果準確，前者優(yōu)于后者。 2.觀察了乙基亞硝基脲(ENU)誘導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和普通小鼠后的動態(tài)外周血嗜多染紅細胞和骨髓嗜多染紅細胞的微核率變

11、化。染毒方法為劑量50mg/kg、100mg/kg，每天1次、腹腔注射方式。誘導(dǎo)后小鼠外周血微核率在第3天迅速上升，在6天達到高峰，此后迅速降低，第21天時微核率已降至本底值的水平。兩種小鼠的試驗結(jié)果基本相同。 3.小鼠淋巴細胞刺激液的制備。結(jié)果顯示其刺激小鼠淋巴細胞的增殖是有效的。 4.設(shè)計了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的hprt基因的9個外顯子PCR引物和mRNA的2個RT-PCR引物，并對其基因組DNA和總mRNA進行了驗證性

12、檢測。結(jié)果顯示GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的hprt基因是完整的，與其源系小鼠C57BL/6J相比未見有差異，提示這些引物序列設(shè)計是可行的，可進一步應(yīng)用于GFP轉(zhuǎn)基因小鼠hprt基因突變檢測試驗。 5.對ENU誘導(dǎo)后的突變模型進行了突變分析：ENU50mg/kg、100mg/kg(每天1次，共5次)誘導(dǎo)后脾淋巴細胞克隆效率(PE)明顯下降，分別為8.6％和7.7％(對照組的PE為10.5％)，而hprt基因突變率(MF)顯著上升，分別為8.

13、2×10-6和11.4×10-6，分別是正常組的8.4倍和11.6倍。對6個突變克隆外顯子1的測序結(jié)果均未見異常，而3個突變克隆的外顯子9卻發(fā)現(xiàn)其中有2個發(fā)生了A:T→T：A顛換(2/3)。 第二部分：甲氧化三丁基錫的一般毒性和遺傳毒性評價。 1.小鼠急性毒性試驗：甲氧化三丁基錫對小鼠的LD50為98mg/kg，其95％可信限為85mg/kg-113mg/kg，回歸方程為Y(幾率單位)=-5.97+5.507×LogD(

14、D：劑量)，其劑量-死亡率關(guān)系為拋物線型。按化學(xué)品的毒性分級標準屬中等毒性。急性中毒的死亡類型不是速死型，多在3-5天發(fā)生。在整個試驗期內(nèi)，甲氧化三丁基錫具有抑制小鼠體重增長的作用。 2.甲氧化三丁基錫小鼠具有遺傳毒性?？蓪?dǎo)致小鼠精子畸形、睪丸的臟器系數(shù)降低。但Ames試驗、CHL染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠脾淋巴細胞hprt基因突變試驗均為陰性結(jié)果。 第三部分：甲氧化三丁基錫誘導(dǎo)人JurkatT淋

15、巴瘤細胞凋亡的分子機制研究。 通過本課題的研究可以得出如下結(jié)論：①GFP轉(zhuǎn)基因小鼠可作為小鼠脾淋巴細胞hprt基因突變試驗的良好模型，具有準確性高、降低了試驗難度等優(yōu)點。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠對模式誘變劑ENU誘導(dǎo)外周血嗜多染紅細胞的微核率與普通小鼠基本相同。結(jié)果證明了新方法是可行有效的。②甲氧化三丁基對小鼠的LDso為98mg/kg，按化學(xué)品的毒性分級劃分標準屬中等毒性，其劑量-死亡率關(guān)系為拋物線型，急性中毒的死亡不是速死型；甲氧化

16、三丁基可抑制小鼠的體重增長，降低睪丸的臟器系數(shù)。③甲氧化三丁基錫具有一定的遺傳毒性，可導(dǎo)致小鼠精子畸形，雄性生殖系統(tǒng)是其主要靶器官之一。但遺傳毒理學(xué)試驗Ames試驗、CHL染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠脾淋巴細胞hprt基因突變試驗為陰性結(jié)果。④甲氧化三丁基可通過線粒體途徑誘導(dǎo)Jurkat人淋巴瘤細胞凋亡，鈣離子是其中最初的信號因子；甲氧化三丁基阻滯Jurkat細胞于細胞周期的S期。凋亡事件包括磷脂酰絲氨酸外翻、ca