中國柑橘黃龍病病原調(diào)查、種群遺傳分化及其原噬菌體溶菌酶蛋白原核表達.pdf

1、柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，在亞洲、非洲、大洋洲和南北美洲的近50個國家和地區(qū)造成為害，在中國20個柑橘產(chǎn)區(qū)（包括臺灣）已有12個遭受HLB為害，且最近又有不斷擴散蔓延的趨勢;HLB病原菌能侵染幾乎所有柑橘類植物，病樹癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，主要表現(xiàn)為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“紅鼻子”果等癥狀，造成植株經(jīng)濟壽命減短，產(chǎn)量降低，果品質(zhì)劣經(jīng)濟價值降低，從而引起巨大

2、的經(jīng)濟損失。由于HLB的病原物尚不能人工培養(yǎng)，因此科赫氏證病亦未完成。目前，國際上普遍認為該病的病原為韌皮部桿菌屬的3個暫定種:亞洲種(‘Candidatus Liberibacterasiaticus’, CLas)、非洲種(‘Ca.L.africanus’，CLaf)和美洲種（‘Ca.L.americanus’，CLam）。目前該病尚無特效藥劑可供治療，也無抗（耐）病品種可供應(yīng)用，只能采取以防為主的防治措施。因此對該病的研究迫在眉睫

3、且具有一定的難度。
　　本研究從病害取樣檢測到田間癥狀識別，再到我國CLas種群分化和流行推測，以及探索防治該病害的新思路進行了較系統(tǒng)的基礎(chǔ)性研究。其中田間診斷標(biāo)準(zhǔn)的確立在實際生產(chǎn)中對病害的準(zhǔn)確識別具有重要的意義，由于HLB田間癥狀的復(fù)雜性，常會造成誤判，如何進行準(zhǔn)確診斷將是面對實際生產(chǎn)中亟待解決的最現(xiàn)實問題。而對病原菌的種群分化研究有助于了解病菌分類、種群結(jié)構(gòu)和病菌流行動態(tài)，同時也為病原類型檢測、病害診斷及風(fēng)險評估提供了一種敏感

4、特異的手段，因此區(qū)分CLas的不同株系對HLB的生態(tài)和流行學(xué)研究十分重要。鑒于國內(nèi)外對CLas遺傳多樣性及種群分化領(lǐng)域研究的不足，尤其是對中國CLas種群內(nèi)部多位點同時分析的缺乏，本學(xué)位論文利用比較基因組分析方法得到大量差異位點，通過篩選獲得用于評價我國CLas的種群多樣性的位點，并對306個樣品進行多位點遺傳多樣性分析。旨在揭示中國CLas種群分化，并進一步探索黃龍病在中國的起源及其流行。HLB病原菌CLas寄生于柑橘體內(nèi)，簡單的化學(xué)

5、防治難度很大，且可操作性不強。CLas基因組中存在編碼CLas原噬菌體的溶菌酶基因，這是CLas噬菌體殺死CLas細胞的有力武器，本論文通過原核表達該溶菌酶，并進一步驗證該基因的溶菌活性，希望借助CLas噬菌體源溶菌酶與韌皮部無毒載體結(jié)合，運用這個工具進行HLB的有效防控，從而為HLB防控提供新思路。目前取得了如下研究成果:
　　1、首次通過在常規(guī)CTAB法DNA提取液中添加增效劑和抗低溫析出劑，獲得了一種增強型新配方CTAB-T

6、riton DNA提取液，并優(yōu)化操作時間，該法無論從質(zhì)量上還是從操作時間上均優(yōu)于常規(guī)CTAB抽提法，而質(zhì)量和產(chǎn)量均高于微量抽提法，產(chǎn)量優(yōu)于DNA提取試劑盒。運用實時熒光定量PCR對感病柚子葉片各部分病原含量進行檢測，明確了柑橘黃龍病的取樣部位應(yīng)為葉柄或主側(cè)脈。這為柑橘產(chǎn)業(yè)各種DNA病害模板樣品的制備提供了一個新參考，同時對HLB病害檢測取樣部位的選擇具有一定的實際指導(dǎo)意義。
　　2、經(jīng)2009-2013年田間柑橘黃化癥狀調(diào)查，我國

7、柑橘系統(tǒng)性黃化癥狀主要由韌皮部桿菌屬的亞洲種韌皮部桿菌引起，從所采集的629份樣品中未發(fā)現(xiàn)美洲種、非洲種韌皮部桿菌和植原體。黃化癥狀樣品分子檢測和室內(nèi)傳毒癥狀觀察表明葉片斑駁型黃化癥狀與CLas最相關(guān)，可作為田間診斷的主要依據(jù)，果實成熟期還可結(jié)合“紅鼻子”果同時進行診斷，以提高田間診斷的高效性和可靠性。本研究明確了我國柑橘主產(chǎn)區(qū)近幾年引起柑橘系統(tǒng)性黃化癥狀的主要病原，確立了HLB田間診斷標(biāo)準(zhǔn)，對HLB田間識別與診斷具有一定的指導(dǎo)意義。<

8、br>　　3、通過CLas與根瘤菌科成員進行比較基因組分析，篩選并設(shè)計79對引物，獲得14個變異位點，其中12個變異較為豐富。對這12對引物進行退火溫度優(yōu)化，得到11個特異性較好的引物對來自中國9省306份CLas樣品和1個巴西CLas樣品進行PCR擴增，其中，6個位點能較好評估中國CLas種群類型，聚類結(jié)果顯示中國CLas共分兩大組，云貴川一組、兩廣閩贛浙為另一組。通過多個變異位點同時對CLas樣品進行分析，從而推測中國CLas可能存

9、在云南和廣東兩個起源中心。這為HLB在中國的起源和流行推測提供了一定的分子依據(jù)。
　　4、首次提出使用（原）噬菌體源溶菌酶進行HLB防控的思路，通過CLas基因組查找，在CLas原噬菌體區(qū)域找到了編碼溶菌酶蛋白的基因，并將其克隆測序驗證序列后，通過構(gòu)建pTXB I-Lysozyme原核表達載體，誘導(dǎo)獲得41 kDa大小的融合蛋白，且融合蛋白均為可溶表達，經(jīng)幾丁質(zhì)柱純化并去除標(biāo)簽，得到大小為19 kDa的溶菌酶蛋白，和預(yù)期預(yù)測完全一

10、致。該研究為后續(xù)CLas原噬菌體溶菌酶功能驗證提供了一定的基礎(chǔ)，并有望將該溶菌酶通過無毒載體引入柑橘韌皮部，發(fā)揮殺菌活性，從而抑制或防治柑橘黃龍病。
　　綜上所述，本研究面對實際生產(chǎn)和應(yīng)用檢測，對HLB的癥狀和CLas的相關(guān)性進行了系統(tǒng)研究，總結(jié)出較為可靠的HLB田間診斷標(biāo)準(zhǔn);通過實驗明確了HLB取樣部位應(yīng)選葉柄或葉脈，而不應(yīng)選取葉肉;應(yīng)用比較基因組篩選多態(tài)性位點的方法對中國CLas進行多位點種群分析，為中國CLas的種群分化和病