抗人可溶性間皮素相關(guān)蛋白單克隆抗體的制備及特性鑒定.pdf

1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文抗人可溶性間皮素相關(guān)蛋白單克隆抗體的制備及特性鑒定姓名：劉雅坤申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：吳小華;單保恩20070301中文摘要克隆抗體( m A b ) ，并對其生物學(xué)特異性進(jìn)行了鑒定。方法：1 應(yīng)用G O L D K E Y 軟件對從N C B I 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中調(diào)出人M S L N 氨基酸序列進(jìn)行分析，對M S L N 的H o p p &W o o d s 親水性參數(shù)、抗原性參數(shù)、可

2、及性參數(shù)、B 一轉(zhuǎn)角等多參數(shù)分別進(jìn)行預(yù)測，然后用吳氏法進(jìn)行綜合分析其準(zhǔn)確性。2 抗S M R 抗體的制備應(yīng)用方法1 選取的S M R 抗原表位的氨基酸序列，合成多肽抗原，免疫B A L B ／c 小鼠，取脾細(xì)胞與S P 2 ／O 小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后，選出抗S M R 抗原表位的陽性克隆，再進(jìn)行亞克隆，將穩(wěn)定分泌抗S M R 抗原表位單克隆抗體的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。抗體效價用E L I S A 法檢測。取～定量雜交瘤細(xì)胞給B A L B

3、 ／c 小鼠腹腔注射，約兩周后收集腹水，得到高效價抗S M R 抗原表位的I g G ，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、S D S ．P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析等方法對抗體進(jìn)行特異性鑒定。3 m A b 的效價、亞類及特異性鑒定3 ．1 效價測定：利用S M R 復(fù)合肽抗原( 1 ／M g ／m L ) 1 ：10 0 0 稀釋包被微孔板，利用E L I S A 法檢測腹水抗體效價。3 ．2 抗體亞類測定：用m

4、A b 亞類分型試劑盒，按試劑盒說明書操作。用P H 7 ．2 ．7 ．6P B S 稀釋鼠抗S M R 單克隆抗體，稀釋度為1 ：2 0 0 0 0 。取1 5 吮l 稀釋好的S M R 單克隆抗體放入試管中，混勻，室溫孵育3 0 分鐘。試管中插入試劑條反應(yīng)5 分鐘，觀察結(jié)果。3 ．3 特異性鑒定：( 1 ) 免疫細(xì)胞化學(xué)( S P ) 法檢測單克隆抗體與問皮素陽性卵巢癌細(xì)胞表面天然蛋白反應(yīng)性。蓋玻片常規(guī)浸酸、沖洗、高壓滅菌后，放置于