CXCR7拮抗劑的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、一、背景
　　 乳腺癌是目前女性發(fā)病率和死亡率排名第一的常見惡性腫瘤。2011年美國(guó)Cancer Journal for Clinicians雜志公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)2011年有230480例女性罹患乳腺癌，其中57650例為新增原發(fā)性乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30％。同樣，在發(fā)展中國(guó)家或地區(qū)乳腺癌現(xiàn)在也是女性癌癥死亡的主因，較十幾年前以宮頸癌為常見的癌癥死亡原因發(fā)生了轉(zhuǎn)變。
　　 乳腺癌具有發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、病

2、程進(jìn)展緩慢、隱蔽性強(qiáng)、不易早期診斷、易于轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。因此，對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究十分重要。乳腺癌是一種血管高度依賴性腫瘤。腫瘤微環(huán)境的改變、原發(fā)性乳腺癌的局部腫瘤微血管生成以及侵襲細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜等每一環(huán)節(jié)都與趨化因子及其受體密切相關(guān)。
　　 趨化因子(chemokine)，也稱趨化激素或化學(xué)激素，是一類由不同類型的細(xì)胞分泌的、能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的、對(duì)免疫細(xì)胞具有趨化作用、相對(duì)低分子質(zhì)量(8～12 kD)的小分

3、子細(xì)胞蛋白家族。趨化因子受體是能夠特異性結(jié)合趨化因子的細(xì)胞膜蛋白，屬于七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，并選擇性地表達(dá)在靶細(xì)胞表面。趨化因子與其受體結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)，參與各種生理、病理過程。
　　 趨化因子CXCL12，又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，有兩種主要形式:SDF-1α和SDF-1β，是已知唯一能與受體CXCR4結(jié)合并能激活它的趨化因子。SDF-1廣泛地表達(dá)于多種

4、細(xì)胞和組織中，包括免疫細(xì)胞、肺、腎、腦、心臟等，是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞生成及淋巴細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因子。趨化因子SDF-1對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用并在發(fā)育中起著重要的作用。在胚胎發(fā)育中，SDF-1誘導(dǎo)造血干細(xì)胞從胎兒肝臟到骨髓的遷徙。在SDF-1缺失的小鼠，其早期胚胎的心臟及大腦發(fā)育異常。
　　 SDF-1通過與CXCR4結(jié)合介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，引起MEK/ERK磷酸化和胞內(nèi)游離的鈣離子增加。同時(shí)，通過形成偽

5、足、調(diào)控腫瘤細(xì)胞表面某些黏附因子的表達(dá)或活性等方式，從而參與形成腫瘤遷移(migration)和轉(zhuǎn)移的有利微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、轉(zhuǎn)移及腫瘤新生血管形成。
　　 CXCR7是SDF-1新發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)受體，與SDF-1結(jié)合能力比CXCR4更強(qiáng)。由于CXCR7缺乏趨化因子受體典型的G蛋白偶聯(lián)受體序列，故SDF-1活化CXCR7后，并不能引起細(xì)胞鈣流變化和細(xì)胞遷移，也不會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)促分裂原活化蛋白激酶(MAP)或PI1激

6、酶/PKB等級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。Ulrike Naumann等發(fā)現(xiàn)，CXCR7能清除其配體SDF-1(CXCL12)及I-TAC(CXCL11)，降低其濃度。在斑馬魚及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，無論配體是否存在，CXCR7都不斷的在質(zhì)膜與細(xì)胞質(zhì)之間的循環(huán)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，SDF-1與誘餌受體CXCR7結(jié)合后，并不激活典型的G蛋白信號(hào)通路，卻能通過β-arrestin激活促分裂原活化蛋白激酶(MAP)。利用CXCR7拮抗劑或β-arrestin siRNA可顯

7、著地減弱內(nèi)源性表達(dá)CXCR7的血管平滑肌細(xì)胞的遷移?？梢?，介導(dǎo)CXCR7信號(hào)通路的是β-arrestin，CXCR7是一個(gè)獨(dú)立的β-arrestin受體。
　　 雖然，目前對(duì)CXCR7的具體功能尚未研究確切，但其在免疫、腫瘤以及血管生成中所發(fā)揮的重要作用毋庸置疑的。CXCR7能促進(jìn)癌細(xì)胞的存活，低表達(dá)CXCR7的野生型MDA-MB-435s乳腺癌細(xì)胞難以在低血清(1％FBS)培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)染CXCR7質(zhì)粒的MDAMB-435

8、s細(xì)胞卻能在同樣條件下存活，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。Wang等發(fā)現(xiàn)，CXCR7在前列腺癌中高度表達(dá)。高密度組織染色微數(shù)列顯示，在侵襲性較強(qiáng)的腫塊，CXCR7蛋白的表達(dá)量更多。CXCR7的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的黏附、侵襲、增殖及存活，CXCR7對(duì)多種參與腫瘤侵襲的分子的表達(dá)都有影響，如CD44、鈣黏著蛋白-11(CDH11)、IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、TGF-β?；贑XCR7的功能多樣性，特異性阻斷CXCR7有望成為癌癥治療的新策略。一些小分子抑制

9、劑如CCX733、CCX266、siRNA及封閉性抗體已經(jīng)應(yīng)用在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究中。但總的來說，CXCR7的表達(dá)調(diào)控機(jī)制、介導(dǎo)生物效應(yīng)的信號(hào)通路尚未研究清楚，有待更進(jìn)一步的深入研究。
　　 本課題組曾對(duì)SDF-1進(jìn)行基因改造，獲得一種CXCR4競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑:SDF-1/54R，并證實(shí)SDF-1/54R可誘導(dǎo)CXCR4內(nèi)吞，使細(xì)胞膜表面CXCR4迅速消失，隨之由CXCR4介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移受到抑制，并且不激活由其介導(dǎo)的下游信號(hào)通路

10、，表現(xiàn)出很好的抗癌作用。但由于獲得的SDF-1/54R蛋白為無生物活性的包涵體，雖較易獲得大量的包涵體蛋白，但后期變性、復(fù)性操作繁瑣，活性蛋白得率也較低。
　　 基于SDF-1新受體CXCR7的發(fā)現(xiàn)和本課題組對(duì)SDF-1/54R的前期研究結(jié)果，我們推測(cè)SDF-1突變體SDF-1/54R也是一種CXCR7特異性拮抗劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制SDF-1/CXCR7介導(dǎo)的乳腺癌增殖與轉(zhuǎn)移。為驗(yàn)證該假說，本課題擬利用基因工程技術(shù)更換SDF-1突

11、變體SDF-1/54R的表達(dá)載體，以獲得可溶表達(dá)的目的蛋白SDF-1/54R。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)篩選到高表達(dá)CXCR7的乳腺癌細(xì)胞，并利用該細(xì)胞考察獲得的SDF-1/54R蛋白對(duì)CXCR7介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為將SDF-1/54R開發(fā)成以CXCR7的靶點(diǎn)的新型多肽類抗癌藥物奠定必要的前期工作基礎(chǔ)。
　　 二、目的
　　 利用基因工程技術(shù)更換SDF-1突變體SDF-1/54R的表達(dá)載體，以獲得可溶表達(dá)的

12、目的蛋白SDF-1/54R，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SDF-1/54R對(duì)SDF-1/CXCR7介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　 三、研究方法
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)篩選高表達(dá)CXCR7的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng):各種乳腺癌細(xì)胞包括MCF-7、MDA-MB-231等，待生長(zhǎng)狀態(tài)良好后胰酶消化，收集細(xì)胞后用PBS洗滌1次、調(diào)整細(xì)胞濃度。再將細(xì)胞重懸于200μL的PBS中，制成單細(xì)胞懸液，并分成體積相等的兩組。其中，實(shí)驗(yàn)組加入1μL

13、CXCR7一抗，混勻后4℃孵育;30min后用PBS充分洗滌細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞于100μL的PBS中，加入0.5μL FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，對(duì)照組加入0.5μLFITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，混勻后4℃孵育;30min后用PBS充分洗滌細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞于200μL的PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的CXCR7的表達(dá)。
　　 2、SDF-1/54R/pET-41a+的構(gòu)建、表達(dá)及純化:為獲得可溶表達(dá)的SDF-1/54R蛋白，以SD

14、F-1/54R/pET-30a+質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增SDF-1/54R基因，PCR產(chǎn)物雙酶切后連接至載體pET-41a+，構(gòu)建重組載體SDF-1/54R/pET-41 a+。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測(cè)。然后通過優(yōu)化表達(dá)條件，如IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、時(shí)間等，確定最佳表達(dá)條件后大量制備SDF-1/54R蛋白。
　　 采用GST親和層析系統(tǒng)純化

15、可溶表達(dá)的融合蛋白。還原型谷胱甘肽沈脫液洗脫，收集目標(biāo)蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)。檢測(cè)正確后，對(duì)純化得到的融合蛋白溶液進(jìn)行透析，以滿足后續(xù)酶切條件。參考腸激酶說明書，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳酶切反應(yīng)體系、時(shí)間、溫度、濃度等條件，切除重組融合蛋白N端的GST-tag，并再次利用GST親和層析系統(tǒng)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行二次分離純化。收集洗脫下來的目的蛋白SDF-1/54R，SDS-PAGE檢測(cè)分析。
　　 3、SDF-1/54R的活性檢測(cè):利用細(xì)胞實(shí)

16、驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)SDF-1/54R的體外活性進(jìn)行檢測(cè)。首先利用已篩選到的CXCR7高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SDF-1/54R誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體CXCR7內(nèi)化的能力，然后利用MTT法檢測(cè)SDF-1/54R對(duì)CXCR7的乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用。趨化實(shí)驗(yàn)考察SDF-1/54R對(duì)CXCR7介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。
　　 四、結(jié)果
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)篩選高表達(dá)CXCR7的乳腺癌細(xì)胞:利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

17、乳腺癌細(xì)胞表面CXCR7的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCR7在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中高表達(dá)，其表達(dá)量分別為68.64％和66.13％，CXCR7在乳腺癌細(xì)胞4T-1中不表達(dá)。
　　 2、SDF-1/54R/pET-41a+的構(gòu)建、表達(dá)及純化測(cè)序:結(jié)果表明，重組表達(dá)載體SDF-1/54R/pET-41 a+構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，成功表達(dá)了可溶性融合蛋白GST-SDF-1/54R。在最佳條件下大量

18、表達(dá)重組融合蛋白GST-SDF-1/54R，并經(jīng)過優(yōu)化純化、透析、腸激酶酶切等相關(guān)技術(shù)路線，最后分離、純化出較高純度的目的蛋白SDF-1/54R。
　　 3、SDF-1/54R的活性檢測(cè):利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SDF-1/54R能夠顯著降低MCF-7細(xì)胞膜表面CXCR7的表達(dá)。MTT法結(jié)果表明SDF-1/54R能在48小時(shí)內(nèi)顯著抑制CXCR7介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。趨化實(shí)驗(yàn)表明SDF-1/54R能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制SDF-

19、1/CXCR7誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移。
　　 五、結(jié)論
　　 1、檢測(cè)的乳腺癌細(xì)胞中MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)CXCR7，其中MCF-7細(xì)胞表達(dá)量最高，達(dá)69.99％。
　　 2、成功利用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出可溶性GST-SDF-1/54R融合蛋白，為獲得大量有活性的SDF-1/54R蛋白奠定基礎(chǔ)。在成功表達(dá)后，優(yōu)化條件，制備去掉GST標(biāo)簽的、具備生物活性的可溶性目的蛋白SDF-1/54