土撥鼠CTLA-4胞外段與HBc融合DNA疫苗的構(gòu)建、真核表達和小鼠免疫.pdf

1、目的構(gòu)建一個新的土撥鼠細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4(wCTLA-4)胞外部分和人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)融合蛋白的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc，并檢測其編碼的融合蛋白在真核細胞中的表達和分泌情況，初步鑒定其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)相應(yīng)抗體生成的情況。為揭示其作用機制和進一步用于慢性患者免疫治療奠定基礎(chǔ)。 方法以德國埃森大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所構(gòu)建的表達wCTLA-4與全長土撥鼠嗜肝病毒核心抗原(WHc)融合蛋白的質(zhì)粒pCTLA-4-C

2、為模板，通過PCR獲得wCTLA-4胞外段和WHc前149位氨基酸融合蛋白編碼基因片段。pcDNA3.1/V5-HIS(C)TOPO(R)TA表達載體克隆獲得帶有V5-HIS標(biāo)簽的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-WHc。經(jīng)酶切鑒定和轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎(BHK)細胞，間接免疫熒光方法檢測融合蛋白表達，證實其構(gòu)建成功。根據(jù)設(shè)計的酶切位點，將其與含人乙型肝炎病毒核心抗原全長基因片段(HBc)的質(zhì)粒pHcex同時雙酶切，然后T4連接酶連接，以HBc基因片段

3、置換pwCTLA-4-WHc質(zhì)粒中的WHc片段。經(jīng)雙酶切鑒定插入片段大小方向正確，得到含土撥鼠CTLA-4蛋白胞外部分和HBc編碼序列的帶有V5-HIS標(biāo)簽的表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細胞，間接免疫熒光方法(IF)檢測融合蛋白的表達。轉(zhuǎn)染人宮頸癌(Hela)細胞，細胞經(jīng)溫和裂解后收集上清與直接收集的細胞培養(yǎng)上清同時以化學(xué)發(fā)光微粒免疫法(CMIA)檢測融合蛋白的表達。純化質(zhì)粒肌肉注射BALB/cJ(H-2d)小鼠雙

4、側(cè)后肢脛前肌，共免疫三次。最后一次免疫3周后，眼眶靜脈取血，分離血清，使用Enzygonost(R)抗-HBc/抗-HBe單克隆抗體試劑盒檢測篩查免疫小鼠抗-HBc/抗-HBe抗體陽性率。 結(jié)果融合蛋白重組質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc經(jīng)雙酶切后均可獲得預(yù)期大小片段，重組體轉(zhuǎn)染的BHK細胞可檢測到HBc抗原特異性免疫熒光，pwCTLA-4-HBc轉(zhuǎn)染Hela細胞后細胞裂解液和培養(yǎng)上清中針對HBeAg的CMIA反應(yīng)呈強陽性，其中培養(yǎng)

5、上清中抗原的相對濃度為細胞裂解液中的10倍。3次免疫結(jié)束后第二周末，wCTLA-4-HBc融合蛋白表達質(zhì)粒免疫組4只動物中，有2只產(chǎn)生了針對HBcAg特異性的抗體(抗-HBc陽性率50％)，其中一只的血清也可檢測到抗-HBe(抗-HBe陽性率25％)。 結(jié)論成功構(gòu)建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表達質(zhì)粒pwCTLA-4-HBc；wCTLA-4-HBc融合蛋白可以在脂質(zhì)體介導(dǎo)下在真核細胞表達并可大量分泌到細胞外培養(yǎng)上清中；表