慢病毒miRNA干擾小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59表達(dá)及功能的研究.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞對維持神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)代謝過程起重要作用，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速分裂增殖，以形成膠質(zhì)瘢痕的形式進(jìn)行修復(fù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞除了作為神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)支持基質(zhì)外，它們所發(fā)揮的免疫作用[1]也越來越受到重視。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活時，可釋放大量的化學(xué)因子、細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)，激活補(bǔ)體[2]，引起神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致各種神經(jīng)功能紊亂。 腦內(nèi)補(bǔ)體的

2、活化，補(bǔ)體調(diào)控分子和補(bǔ)體受體在CNS內(nèi)的表達(dá)，對腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫防御具有重要作用，但同時也成為腦內(nèi)炎癥和變性疾病的重要致病因素[3]。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[4]都可以分泌各種補(bǔ)體蛋白，它們在體外培養(yǎng)時，補(bǔ)體蛋白的組成性表達(dá)較少，但受到細(xì)胞因子刺激后表達(dá)上調(diào)。補(bǔ)體在大腦內(nèi)是正常存在的，它可以作為獨(dú)立的炎癥系統(tǒng)，積極參與到大腦抵御外來抗原入侵的防御中。補(bǔ)體在CNS內(nèi)的異常活化或調(diào)節(jié)失衡，與很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有關(guān)聯(lián)，成為神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病和

3、非炎性疾病重要的致病因素。研究資料顯示，補(bǔ)體系統(tǒng)的活化伴隨著阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)的整個病理過程，補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的損害是Aβ細(xì)胞毒性作用機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一[5]。 補(bǔ)體的激活是一種高度有序的級聯(lián)反應(yīng)，其過度激活或調(diào)節(jié)失控會對自身組織細(xì)胞造成損傷，體內(nèi)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子可與不同的補(bǔ)體成分相互作用，使補(bǔ)體激活與抑制處于精細(xì)的平衡狀態(tài)。CD46、CD55、CD59是三種重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它們在補(bǔ)體活化

4、的不同階段對其進(jìn)行調(diào)控。膜輔蛋白(Membranecofactorprotein，CD46)作為清除C3、C5轉(zhuǎn)化酶的Ⅰ因子的輔助因子發(fā)揮作用。促衰變因子(Decayacceleratingfactor，CD55)直接結(jié)合C3b,C4b，促進(jìn)C3和C5轉(zhuǎn)化酶的自身衰變。保護(hù)素[6](Protectin，CD59)通過結(jié)合C8，調(diào)節(jié)C5b-9復(fù)合物的形成和功能，還可以與C9結(jié)合并限制其多聚性，從而阻止C9的裝配及其插入膜內(nèi)，防止攻膜復(fù)合物

5、(Membraneattackcomplex,MAC)對同種或自身細(xì)胞的溶解破壞。 目前，雖然針對補(bǔ)體系統(tǒng)在CNS多種疾病中的作用已有不少試驗(yàn)研究，但是在生理和炎癥情況下補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)情況如何國內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。為了探討炎癥因子刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化前后補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55、CD59的表達(dá)情況，以及干擾CD59表達(dá)后星形膠質(zhì)細(xì)胞抵御補(bǔ)體攻擊的能力，我們進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)研究： 1.分離培養(yǎng)

6、新生小鼠大腦皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)特征及免疫熒光檢測細(xì)胞膜上特異性抗原(Glialfibrillaryacidprotein，GFAP)進(jìn)行鑒定，細(xì)胞符合試驗(yàn)要求。 2.用LPS(100U/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)刺激原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞株CRL2541后，RT-PCR、免疫熒光法檢測細(xì)胞刺激前后補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞株CRL2541在mRNA水平有CD55和CD5

7、9組成性表達(dá)，蛋白水平檢測到CD59表達(dá)，而CD46均未見表達(dá)；炎癥刺激因子刺激后CD59和CD55表達(dá)未見明顯增強(qiáng)；CD46仍未檢測到表達(dá)。 3.體外合成基于miRNA骨架的干擾片段，連入pPRIMER慢病毒載體，經(jīng)酶切、測序鑒定證實(shí)，成功構(gòu)建了針對小鼠CD59a的慢病毒miRNA載體。 4.對干擾載體進(jìn)行病毒包裝，病毒上清感染星形膠質(zhì)細(xì)胞株，48h熒光顯微鏡下可見GFP陽性細(xì)胞，證明病毒包裝成功。病毒感染的細(xì)胞被傳代

8、后可以用于下面的實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄PCR及免疫熒光結(jié)果表明：帶有干擾片段的慢病毒感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，CD59的表達(dá)受到抑制。補(bǔ)體殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞上CD59的表達(dá)受干擾后抵御補(bǔ)體攻擊的能力下降。 以上結(jié)果明確了補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞株CRL2541上的表達(dá)情況，以及炎癥刺激因子對其表達(dá)的影響。通過構(gòu)建針對小鼠CD59a的慢病毒miRNA載體，成功地抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞上CD59的表達(dá)，為進(jìn)一步深入