鞘內間斷注射不同濃度羅哌卡因在長時間對大鼠脊髓神經毒性影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察鞘內間斷注射0.5％和1％羅哌卡因后28天對大鼠脊髓、神經根超微結構的影響及機制研究，探討ERK信號通路、Akt信號通路是否參與了羅哌卡因的脊髓神經毒性;觀察鞘內間斷注射1％羅哌卡因+神經營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3)后28天對大鼠脊髓、神經根超微結構的影響及機制，探討neurotrophin-3(NT-3)是否能減輕和預防羅哌卡因的神經毒性作用。
　　2.體外觀察NT-3對于羅哌卡因細胞毒性

2、的影響。為臨床上連續(xù)腰麻更安全使用羅哌卡因提供理論依據。
　　方法:
　　1.改良Yaksh法鞘內置管成功的雄性SD大鼠144只，體重280～320g，月齡為1.5月。隨機分為生理鹽水組（NS組，n=36），0.5％羅哌卡因組（M組，n=36），1％羅哌卡因組（R組，n=36），1％羅哌卡因+NT-3組（T組，n=36）。NS組大鼠鞘內注入0.9％生理鹽水、M組大鼠鞘內注入0.5％羅哌卡因、而R組和T組大鼠鞘內注入1％羅哌卡

3、因各0.12 ml/kg，間隔1.5h給藥一次，持續(xù)給藥12h。其中T組同時再鞘內注入0.1 mg/kg的NT-3。各組均觀察1d、3d、5d、7d、14d、28d。NS組記為“NS1組、NS3組、NS5組、NS7組、NS14組、NS28組”(n=6)。M組記為“M1組、M3組、M5組、M7組、M14組、M28組”(n=6)。R組記為“R1組、R3組、R5組、R7組、R14組、R28組”(n=6)。T組記為“T1組、T3組、T5組、T7

4、組、T14組、T28組”(n=6)。分別檢測給藥前和各時間點處死前各組大鼠后肢機械刺激縮足反應閾值即機械痛閾和熱潛伏縮爪閾值即熱痛閾以及最后一次給藥后運動功能評分來觀察其行為學的變化;完成行為學檢測后的各組大鼠，取脊髓腰膨大及相應節(jié)斷行光鏡和透射電鏡觀察，并進行病理學評分;Tunel法檢測脊髓凋亡;免疫組化檢測各組大鼠腰膨大脊髓ERK1(P44 MAPK)、Akt及caspase-3蛋白的表達;Western-blot檢測各組磷酸化ER

5、K和磷酸化Akt蛋白表達及相對定量比隋況。
　　2.細胞實驗:體外觀察NT-3對于羅哌卡因細胞毒性的影響將PC12細胞分為三組:對照組(NS組):不予任何處理，常規(guī)培養(yǎng)48小時;羅哌卡因組（R組）:15mM羅哌卡因干預48h;羅哌卡因+NT-3組（T組）:15mM羅哌卡因干預48h并同時給予NT-3100ng/ml處理48小時。檢測干預后每組細胞計數;MTT方法測定細胞成活率的變化;臺盼蘭染色測定每組細胞活性;Western bl

6、ot法檢測各組細胞磷酸化ERK和磷酸化Akt蛋白表達及相對定量比情況。
　　結果:
　　1.NS組和M組各對應時間組相比，大鼠機械性觸誘發(fā)痛閾和熱刺激誘發(fā)痛閾無顯著性差異。各組大鼠機械性觸誘發(fā)痛閾與NS組和M組各對應時間組相比:R1、R3、R5組和T1、T3組大鼠機械觸誘發(fā)痛閾升高(P＜0.05)，其中以R1組升高最明顯;與R組相對應時間組相比:T5組大鼠機械痛閾顯著降低(P＜0.05)。與NS組和M組各對應時間組相比:R1

7、、R3、R5組和T1、T3組大鼠熱刺激誘發(fā)痛閾升高(P＜0.05)，其中以R1組升高最明顯。與R組相對應時間組相比:T5組大鼠熱刺激誘發(fā)痛閾顯著降低(P＜0.05)。
　　2.電鏡和光鏡結果。電鏡:R組給藥后R1、R3、R5、R7、R14、R28組電鏡超微結構有不同程度的改變。R1組水腫明顯，神經細胞呈固縮狀，核碎裂，大多數空泡狀，有凋亡小體出現，R3組神經細胞線粒體清晰，核皺縮，神經細胞局灶水腫，R5組部分神經細胞核皺縮，內質網

8、輕度擴張，神經細胞有部分腫脹，R7組局灶水腫明顯，部分線粒體結構模糊，內質網有輕度擴張，部分神經細胞有皺縮，R14組神經細胞腫脹、水腫，線粒體丟失，呈空泡狀，內質網有輕度擴張，R28組郎飛氏結正常。而T組中的對應時間組:T1組胞核花邊狀，皺縮，有凋亡小體出現的趨勢，線粒體結構完整，T3組神經細胞核圓，線粒體結構清晰，輕度水腫，T5組線粒體清晰，內質網有輕度擴張，核完整，輕度水腫，T7組神經細胞核輕度皺縮，部分線粒體空泡狀，水腫部明顯，T

9、14組趨向正常，細胞核圓，線粒體嵴清晰，內質網結構正常，T28組形態(tài)正常。光鏡:R1、R3、R5、R7組神經元數量較少，體積明顯縮小，核明顯固縮、深染。個別神經元壞死，部分膠質細胞有增生。R14及R28組神經元數量較多，部分有軸突，部分體積縮小，核固縮、深染。T1、T3、T5組神經元數量減少，體積縮小，核固縮、深染，T5組神經元數量比R5組多，有點狀壞死。 T7組部分神經元細胞形態(tài)正常，大部分可見長軸突，部分神經元體積縮小，核固縮、深染

10、，膠質細胞增生。T14組部分神經元軸突消失，胞漿少，T28組神經元細胞數量比R28多，形態(tài)正常。R組和T組的各對應時間組的組織病理學評分在1d、3d、5d、7d，14d分別較NS組和M組各對應時間高，以R組最高(P＜0.05);與R組的各對應時間組比較， T組各對應時間點的T5、T7、T14組的組織病理學評分顯著降低(P＜0.05)。NS組和M組的電鏡結果基本正常。
　　3.TUNEL染色陽性細胞計數的結果:與NS組的同時間對應組

11、比較，M組染色陽性細胞無顯著性增多。與NS組和M組的同時間對應組比較T1、T3、T5組TUNEL染色陽性細胞增多(P＜0.05);R組的R1、R3、R5、R7組染色陽性細胞增多(P＜0.05)。與R組同時間對應組比較T組的R1、R5、R7組染色陽性細胞顯著減少(P＜0.05)。
　　4.免疫組化檢測的Akt、ERK1、caspase-3 Akt:R1、R3、R5組以及T1、T3組與NS和M組的對應時間組比較，脊髓灰質后角Akt陽性

12、表達顯著升高(P＜0.05); T3、T5、T8組與R組對應時間組比較，Akt陽性表達顯著降低（P＜0.05）。ERK1:R1、R3、R5、R7、R14組以及T1、T3、T5、T7組與NS和M組的對應時間組比較，脊髓灰質神經元細胞的ERK1陽性表達顯著升高（P＜0.05）;T1、T3、T5、T14組與R組對應時間組比較，ERK1陽性表達顯著降低(P＜0.05)。 caspase-3:R1、R3、R5、R7、R14組以及T1、T3、T5、

13、T7組與NS和M組的相對應時間組比較，脊髓灰質后角caspase-3陽性表達顯著升高（P＜0.05）;T1、T3、T5、T14組與R組相對應時間組比較，caspase-3陽性表達顯著降低(P＜0.05)。與NS組的同時間對應組比較，M組免疫組化檢測的Akt、ERK1、caspase-3無顯著性差異。
　　5.Western blot法測定脊髓腰膨大組織磷酸化ERK以及磷酸化Akt結果與NS組各對應時間組相比，M組脊髓腰膨大組織磷酸

14、化ERK蛋白表達水平以及磷酸化Akt蛋白表達水平無顯著性差異。與NS組各對應時間組相比:R1、R3、R5、R7、R14、R28組和T1、T3、T5、T7、T14組磷酸化Akt蛋白表達水平降低(P＜0.05)，其中以R1、R3組水平降低最明顯;與R組相對應時間的各組相比:T組與之相對應時間的T5、T7、T28組磷酸化Akt蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)。與NS組各對應時間組相比:R1、R3、R5、R7組和T1、T3、T5、T7組磷酸

15、化ERK蛋白表達水平降低(P＜0.05)，其中以R1、R3組降低最明顯;與R組相對應時間的各組相比:T1、T3組磷酸化ERK蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)。
　　6.體外細胞實驗說明:與NS組比較，R組和T組的細胞計數和細胞存活率均減少、細胞活性降低(P＜0.05)，而蛋白表達均降低(P＜0.05)，與R組相比較，T組的細胞計數和細胞存活率、細胞活性均增高（P＜0.05），蛋白表達均升高(P＜0.05)。
　　結論:<

16、br>　　1.間斷鞘內注射0.5％羅哌卡因12h的各組大鼠脊髓神經根超微結構、組織病理學在1～28天無改變。
　　2.間斷鞘內注射1％羅哌卡因12h的各組大鼠脊髓神經根超微結構、組織病理學在1～7天發(fā)生改變較重，產生的凋亡細胞較多。隨著時間的延長，病理改變逐漸恢復，在28天時大部分恢復正常。
　　3.間斷鞘內注射1％羅哌卡因+NT-312h的各組大鼠脊髓神經根超微結構、組織病理學在1～7天發(fā)生改變輕微，產生的凋亡細胞少。隨著