骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對不同線性增加的流體剪應(yīng)力的響應(yīng).pdf

1、本研究以 SD大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為研究對象,通過平板流動腔裝置施加流體剪應(yīng)力,從細(xì)胞早期的力學(xué)敏感性響應(yīng)指標(biāo),即細(xì)胞內(nèi)鈣離子[Ca2+]i響應(yīng)水平、一氧化氮(NO)的釋放量以及細(xì)胞骨架中微絲(F-actin)的重排情況來考察BMSCs對不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激的力學(xué)敏感性響應(yīng);從細(xì)胞骨向分化標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)和軟骨向分化標(biāo)志物糖苷聚糖(GAG)的表達(dá)水平,研究不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激對BMSC分化的

2、影響;考察不同線性增加的流體剪應(yīng)力對BMSCs的力學(xué)敏感型鈣離子通道開放的貢獻(xiàn),以及力學(xué)敏感型鈣離子通道對細(xì)胞力學(xué)敏感性的影響。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　采用全骨髓懸液直接貼壁的方法獲取6周齡SD大鼠BMSCs,細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)擴(kuò)增,用于實(shí)驗(yàn)的為第三、四代細(xì)胞。運(yùn)用本課題組設(shè)計(jì)的平板流動腔裝置分別對BMSCs施加三種不同線性增加的流體剪應(yīng)力20分鐘,即0分鐘從0dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2、2分鐘從0

3、dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2、20分鐘從0dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2(分別簡化為0-0’、0-2’、0-20’)。采用流體剪應(yīng)力加載下實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)的成像技術(shù)手段,記錄BMSCs對三種加載方式的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)情況;對0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式分別作用于BMSCs20分鐘后細(xì)胞中連續(xù)F-actin的密度進(jìn)行定量分析;以及對三種加載方式分別作用于BMSCs1小時(shí)的過程中,系統(tǒng)內(nèi)NO的濃

4、度變化進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0-2’的加載方式刺激BMSCs的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平、胞內(nèi)連續(xù)F-actin聚合程度以及NO釋放量最大,其次是0-0’,最后是0-20’。將細(xì)胞在0-2’、0-20’兩種加載方式作用下出現(xiàn)第一個(gè)鈣峰時(shí)對應(yīng)的流體剪應(yīng)力,即1dyn/cm2、0.1dyn/cm2分別作用于BMSCs20分鐘并實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)情況。進(jìn)行比較得到,仍然是0-2’加載方式作用下BMSCs胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)水平最大,呈現(xiàn)0-2’>0

5、-0’>0-20’>1dyn/cm2>0.1dyn/cm2的現(xiàn)象。這意味著BMSCs能夠識別不同線性增加的流體剪應(yīng)力,并且對三種不同的加載方式表現(xiàn)出不同的力學(xué)敏感性響應(yīng),加載方式對細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)是有貢獻(xiàn)的。
　　為進(jìn)一步探究0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式對BMSC分化的影響,分別對細(xì)胞進(jìn)行三種方式的力學(xué)刺激20分鐘后靜置培養(yǎng)48小時(shí),隨后檢測細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)和糖胺聚糖(GAG)的表達(dá)。發(fā)現(xiàn),0-2’加載方式后B

6、MSCs中ALP含量最高,其次是0-20’,最后是0-0’;而GAG的結(jié)果則相反,0-0’加載方式后BMSCs的GAG含量最高,其次是0-20’,最后是0-2’。表明,0-2’加載方式有利于BMSC骨向分化,0-0’加載方式有利于BMSCs軟骨向分化。
　　在發(fā)現(xiàn)以上現(xiàn)象的基礎(chǔ)上,我們從細(xì)胞力學(xué)敏感型鈣離子通道的角度出發(fā),探索是否由于0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式對BMSCs的力學(xué)敏感型鈣離子通道的影響不同,進(jìn)而影響了

7、BMSCs的力學(xué)敏感性。利用力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑(Gadolinium,GdCl3)對BMSCs進(jìn)行預(yù)處理,同樣觀測了三種加載方式分別作用于BMSCs20分鐘的細(xì)胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平以及20分鐘后胞內(nèi)連續(xù)F-actin的聚合程度,發(fā)現(xiàn),0-0’加載方式下細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平和胞內(nèi)連續(xù)F-actin的聚合程度最高,其次是0-2’,最后是0-20’,但是都沒有顯著性差異。BMSCs受力刺激20分鐘再靜置培養(yǎng)48小時(shí)后0-2’的GAG

8、的表達(dá)相對最高,其次是0-0’,最次是0-20’,并沒有顯著性差異;而0-0’的ALP的表達(dá)相對最高,其次是0-2’,最次是0-20’,彼此也沒有顯著性差異。表明,力學(xué)敏感型鈣離子通道被阻斷后,BMSCs對不同線性增加的流體剪應(yīng)力不表現(xiàn)差異性響應(yīng)。力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控了BMSC對不同線性增加流體剪應(yīng)力刺激的力學(xué)敏感性。
　　研究結(jié)果顯示,BMSCs流體剪應(yīng)力刺激具有高度敏感性,力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控了BMSC對不同線性增加流