大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系葉綠體基因組的測(cè)序與分析.pdf

1、大豆是重要的糧食和油料作物。也是沒有規(guī)?；瘧?yīng)用雜種優(yōu)勢(shì)來提高產(chǎn)量的主要農(nóng)作物。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院根據(jù)發(fā)現(xiàn)的大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)材料，率先實(shí)現(xiàn)了“三系”配套，并在2002年育成并審定了世界上首個(gè)大豆雜交種“雜交豆1號(hào)”。使我國(guó)在雜交大豆應(yīng)用領(lǐng)域處于世界領(lǐng)先地位。但在大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳規(guī)律和不育機(jī)理等基礎(chǔ)理論研究方面，我國(guó)仍處在初級(jí)階段，還需進(jìn)一步的深入研究。
　　葉綠

2、體作為植物細(xì)胞所特有的細(xì)胞器，廣泛存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并在植物光合作用等生理過程中發(fā)揮重要作用，葉綠體的基因組(cpDNA)經(jīng)常與核基因組傳遞遺傳物質(zhì)。因此在分析研究大豆質(zhì)核互作雄性不育分子機(jī)理時(shí)，除了考慮線粒體以外，也要關(guān)注葉綠體基因組。然而目前有關(guān)葉綠體基因組對(duì)CMS影響的研究并不完全，是否與大豆雄性不育相關(guān)，也沒有確切性的結(jié)論。因此本研究對(duì)大豆RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系JLCMS9A及其同型（細(xì)胞核基因組成相同）保持系JLCMS

3、9B使用Illumina的Hiseq2000測(cè)序系統(tǒng)針對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行了高通量測(cè)序，根據(jù)測(cè)序獲得的基因組序列結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析并使用分子生物學(xué)手段進(jìn)行驗(yàn)證，以期尋找不育細(xì)胞質(zhì)的葉綠體分子標(biāo)記和葉綠體參與調(diào)控大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的新證據(jù)。
　　1、使用Illumina的Hiseq2000測(cè)序系統(tǒng)對(duì)大豆RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系JLCMS9A及其同型保持系JLCMS9B的葉綠體DNA進(jìn)行denovo測(cè)序，獲得了包含有大豆葉綠體基因組的原

4、始reads;通過數(shù)據(jù)過濾，除去短序列、接頭和細(xì)胞核基因組的reads，根據(jù)參考序列挑選出大豆葉綠體基因組的clean reads（其中JLCMS9A:1，043，280bp;JLCMS9B:865，510bp）;利用AbySS+SSPACE+Gapclose進(jìn)行初步組裝，對(duì)JLCMS9A和JLCMS9B的葉綠體基因組測(cè)序的初步序列進(jìn)行分析，得到需要填補(bǔ)的gap，根據(jù)已有序列和參考基因組的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR補(bǔ)洞，最終得到JLCMS9

5、A和JLCMS9B的葉綠體基因組完整序列;其中JLCMS9A的葉綠體基因組完整序列長(zhǎng)度為152，222bp，JLCMS9B的葉綠體基因組完整序列長(zhǎng)度為152，215bp。
　　使用DOGMA軟件對(duì)JLCMS9A和JLCMS9B的葉綠體基因組完整序列進(jìn)行基因組成分析和基因功能分析。并根據(jù)CpBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了基因注釋。發(fā)現(xiàn)JLCMS9A和JLCMS9B的葉綠體基因組均由96個(gè)mRNA、39個(gè)tRNA和8個(gè)rRNA組成。
　　

6、2、將JLCMS9A和JLCMS9B的葉綠體基因組的測(cè)序結(jié)果與大豆參考葉綠體基因組(PI437654)進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)大豆葉綠體基因組高度保守，其基因組排布與組成高度一致，均由96個(gè)mRNA、39個(gè)tRNA和8個(gè)rRNA組成。在JLCMS9A和JLCMS9B的葉綠體基因組DNA之間，存在著46個(gè)SNPs和3個(gè)InDels，其中23個(gè)SNPs位于基因區(qū)。平均每3.3kb出現(xiàn)1個(gè)SNP，遠(yuǎn)低于栽培大豆核基因組平均每0.44kb出現(xiàn)1個(gè)

7、SNP的頻率。
　　3、使用PCR方法對(duì)已育成的不育系及其配套的保持系材料進(jìn)行SNPs驗(yàn)證，共選取了12個(gè)RN型雄性不育細(xì)胞質(zhì)的不育系及其配套的60個(gè)保持系材料，這些材料地域分布廣泛，種質(zhì)資源分別來源于中國(guó)、美國(guó)和日本等3個(gè)國(guó)家，能夠廣泛的代表不育細(xì)胞質(zhì)來源。驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，23個(gè)基因編碼區(qū)的SNPs和3個(gè)位于非編碼區(qū)的SNPs普遍存在于RN型雄性不育細(xì)胞質(zhì)（不育系）和同型可育的細(xì)胞質(zhì)（保持系）中。
　　4、建立了大豆RN型細(xì)

8、胞質(zhì)雄性不育系葉綠體特異標(biāo)記PCR快速篩選方法。通過PCR擴(kuò)增其中4個(gè)SNPs片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生大小不同的片段，開發(fā)了4個(gè)可見的分子標(biāo)記，可以區(qū)分大豆RN型及其他類型雄性不育系和保持系;并且還可以區(qū)分雜交種和大豆保持系。4個(gè)葉綠體特異標(biāo)記特征如下:
　　(1)標(biāo)記RE1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度463bp，用限制性內(nèi)切酶Bpu10Ⅰ酶切后，可育細(xì)胞質(zhì)（保持系）的酶切片段長(zhǎng)度不變，不育細(xì)胞質(zhì)（不育系）被切為兩段，長(zhǎng)度分別為25

9、5bp和208bp。
　　(2)標(biāo)記RE2，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為489bp，用限制性內(nèi)切酶psiⅠ酶切后，可育細(xì)胞質(zhì)（保持系）的酶切片段長(zhǎng)度不變，不育細(xì)胞質(zhì)（不育系）被切為兩段，長(zhǎng)度分別為323bp和166bp。
　　(3)標(biāo)記RE3，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為490bp，用限制性內(nèi)切酶psiⅠ酶切后，可育細(xì)胞質(zhì)（保持系）的酶切片段長(zhǎng)度不變，不育細(xì)胞質(zhì)（不育系）被切為兩段，長(zhǎng)度分別為288bp和192bp。
　　(4)標(biāo)

10、記RE4，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為399bp，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切，可育細(xì)胞質(zhì)（保持系）的酶切片段長(zhǎng)度不變，不育細(xì)胞質(zhì)（不育系）被切為兩段，長(zhǎng)度分別為247bp和152bp。
　　5、不育系JLCMS9A和保持系JLCMS9B葉綠體基因組之間在編碼區(qū)共存在23個(gè)SNPs，而保持系JLCMS9B（可育材料）與PI437654測(cè)序的參考基因組（可育材料）之間存在20個(gè)SNP，這20個(gè)SNP也存在于不育系JLCMS9A和保持系JL

11、CMS9B之間，包含在23個(gè)SNP之內(nèi)。因此不育系JLCMS9A和保持系JLCMS9B之間剩余的3個(gè)SNP，即為JLCMS9A所特有，很可能與大豆雄性不育相關(guān)。這3個(gè)SNP分別發(fā)生在matK和ycfl基因區(qū)域，因此使用qPCR(Real-time fluorescence quantitative PCR amplification)對(duì)這兩個(gè)基因在不育系、保持系、恢復(fù)系的花苞期葉片和花苞材料中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性分析。發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因在保持系的

12、表達(dá)水平最高，恢復(fù)系的表達(dá)水平最低，而不育系的表達(dá)水平位于兩者之間。由于不育細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)豐度位于兩個(gè)可育細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)豐度之間，所以無(wú)法判斷這兩個(gè)基因與大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)。
　　就已報(bào)道的研究結(jié)果來看，細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)，而葉綠體作為細(xì)胞質(zhì)中重要的細(xì)胞器，是否參與了調(diào)控機(jī)制不得而知，本研究對(duì)不育系JLCMS9A和保持系JLCMS9B的葉綠體基因組進(jìn)行了高通量測(cè)序并使用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段進(jìn)行了系