大鼠肝再生過程中細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究.pdf

1、人和動(dòng)物的肝臟具有極強(qiáng)的再生能力,大鼠肝70％切除后可在7-10天內(nèi)基本恢復(fù)原有的體積和功能。肝組織再生是在機(jī)體正反兩方面因素調(diào)控下的復(fù)雜過程。目前對(duì)肝再生的研究,主要集中在參與這個(gè)復(fù)雜過程的正調(diào)機(jī)制,如發(fā)現(xiàn)包括肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)、表皮生長因子(EGF)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、胰島素和去甲腎上腺素等在內(nèi)的多種激素、生長因子和細(xì)胞因子對(duì)肝再生的啟動(dòng)和順利進(jìn)行起促進(jìn)作用。相對(duì)于

2、對(duì)正調(diào)機(jī)制的認(rèn)識(shí),目前人們對(duì)肝再生負(fù)調(diào)機(jī)制的了解相對(duì)較少,肝再生終止和肝臟組織結(jié)構(gòu)重塑機(jī)制等問題仍不清楚。由于肝再生的終止是由機(jī)體主動(dòng)調(diào)控的細(xì)胞增生停止過程。因此,從負(fù)調(diào)機(jī)制角度對(duì)肝再生進(jìn)行研究,闡明調(diào)控肝再生終止和肝臟組織結(jié)構(gòu)重塑的分子機(jī)制,不僅有助于全面認(rèn)識(shí)肝臟再生,同時(shí)對(duì)肝臟疾病,尤其是肝臟腫瘤病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)和治療靶點(diǎn)的探索等都具有十分重要的意義。 近年來,作為一種負(fù)調(diào)機(jī)制,凋亡對(duì)肝再生終止和組織結(jié)構(gòu)重塑的作用受到廣泛關(guān)注

3、。理論上,機(jī)體通過凋亡可抑制細(xì)胞無限制的分裂增生,參與重塑肝組織結(jié)構(gòu),使再生反應(yīng)在肝臟組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常時(shí)即停止。近年來的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了凋亡對(duì)肝再生過程的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),肝再生早期凋亡執(zhí)行酶caspase-3的活性顯著增高。凋亡相關(guān)因子Fas、TGFβ和Bcl-2等的轉(zhuǎn)錄水平在肝再生過程中出現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化。這些研究初步表明肝再生過程伴隨肝細(xì)胞凋亡活性的改變,但這些研究大多集中在肝臟再生早期,并存在相互矛盾的結(jié)果。目前,對(duì)于

4、肝再生過程中尤其是后期細(xì)胞凋亡活性變化規(guī)律、參與調(diào)控肝再生終止和肝組織結(jié)構(gòu)重塑的凋亡相關(guān)基因,以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等介導(dǎo)凋亡信號(hào)途徑的作用,這些內(nèi)容還缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究?；谏鲜龇治?本課題利用大鼠肝再生模型和特異性藥物介入處理,研究肝再生過程中凋亡活性變化規(guī)律并探索其分子機(jī)制,具體分為以下幾個(gè)方面： 第一部分 大鼠肝再生過程中細(xì)胞凋亡活性變化規(guī)律研究 由于肝臟再生過程中凋亡肝細(xì)胞所占比例相對(duì)較小,為獲得客觀的數(shù)據(jù)和結(jié)論,

5、我們選擇了多個(gè)指標(biāo)對(duì)肝細(xì)胞凋亡變化規(guī)律進(jìn)行客觀的評(píng)價(jià)。我們首先觀察了肝再生度和再生指數(shù),以及可以間接反映肝臟損傷情況的血清ALT和AST水平等指標(biāo)在肝再生過程中的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PH后1d時(shí)肝臟的體積和體質(zhì)量開始有明顯的增長,到7d時(shí)達(dá)到峰值。血清AST和ALT水平在術(shù)后3h開始升高,1d達(dá)到峰值,7d后恢復(fù)到與SH組無顯著性差別的水平。Caspase-3的活性在肝再生后3h和6h顯著增高,隨即恢復(fù)正常,在肝再生后7d和9d再次升高,

6、到11d逐漸恢復(fù)正常。肝再生過程中caspase-3的上游酶caspase-8、9、12以及calpain等的活性變化規(guī)律在時(shí)相上與caspase-3基本一致。其中,caspase-9的激活幅度較大,而caspase-12和calpain的激活幅度則相對(duì)較小。肝再生后1d和后期血清TNFα水平升高,TNFα在1d的升高與caspase-3的激活無明顯相關(guān)性,但在后期的增高與caspase-3的激活在時(shí)相上具有一致性。 這些結(jié)果提

7、示,凋亡是肝再生過程中的重要事件,肝再生早期和后期凋亡活性顯著增高。結(jié)合文獻(xiàn)我們推測,肝再生早期凋亡活性的增高可能源于手術(shù)引起的應(yīng)激反應(yīng),對(duì)肝再生的啟動(dòng)可能具有重要的影響,后期凋亡活性的增高則對(duì)再生的終止和肝組織結(jié)構(gòu)重塑起重要作用。同時(shí),內(nèi)外源性途徑均可能參與凋亡執(zhí)行酶caspase-3的激活。 第二部分 肝再生過程中凋亡相關(guān)基因的篩選 為篩選參與調(diào)控肝再生的凋亡相關(guān)分子并進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制,我們采用大鼠10k cD

8、NA表達(dá)譜芯片對(duì)肝再生過程中(3h、6h、1d、3d和7d)差異表達(dá)的凋亡相關(guān)基因進(jìn)行了篩選,并用半定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),包括激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system,KKS)內(nèi)多個(gè)成分、神經(jīng)顆粒素(neurogranin,RC3)、脂酰輔酶A結(jié)合蛋白(Acyl-CoA-binding protein,ACBP)和線粒體型超氧化物歧化酶(Mitochondrial superoxide dismuta

9、se,SOD2)等在內(nèi)的200余條凋亡相關(guān)基因參與調(diào)控肝再生。術(shù)后3h、6h、1d、3d和7d差異表達(dá)的凋亡相關(guān)基因總數(shù)分別為60、124、64、81和64條。對(duì)這些基因進(jìn)行的RT-PCR證實(shí)了基因芯片結(jié)果的可靠性。 第三部分 線粒體通路對(duì)肝再生過程中凋亡酶激活作用的研究 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在內(nèi)源性凋亡信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要作用,其開放直接導(dǎo)致凋亡因子的釋放和凋亡酶caspase-9等的激活。由于氧自由基是誘導(dǎo)線粒體通透

10、性轉(zhuǎn)換孔開放的最常見因素,因此我們首先測定了肝再生過程中肝組織中NO含量,NO合酶及GSH-Px活力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在肝再生早期,自由基含量增高,抗氧化能力同時(shí)降低。這一結(jié)果提示,在肝再生早期機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀況。在肝再生后期,自由基含量增高,機(jī)體抗氧化能力也增高,但時(shí)間相對(duì)滯后,且一直持續(xù)到術(shù)后11d。這一結(jié)果提示,在肝再生后期組織內(nèi)自由基含量增多,同時(shí)抗氧化能力適應(yīng)性提高。為進(jìn)一步證實(shí)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔對(duì)肝再生過程中凋亡酶激活的作用

11、,我們采用線粒體通透性轉(zhuǎn)換抑制劑環(huán)孢菌素處理動(dòng)物,檢測肝再生過程中凋亡活性和自由基含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),環(huán)孢菌素處理顯著降低凋亡酶caspase-3和9的活性并抑制自由基的生成。 第四部分 外源性通路對(duì)肝再生過程中凋亡酶激活作用的研究 為闡明枯否氏細(xì)胞在凋亡酶激活過程中的作用,我們采用肝臟枯否氏細(xì)胞阻斷劑氯化釓處理動(dòng)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),枯否氏細(xì)胞被阻斷后,血清TNFα和組織capase-8水平顯著下降,同時(shí)caspase-3的

12、活性也出現(xiàn)部分下降。 第五部分 激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)在肝再生過程中表達(dá)及作用的初步研究 1.激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)在肝再生過程中表達(dá)的研究 基因芯片的結(jié)果顯示,激肽釋放酶.激肽系統(tǒng)內(nèi)多個(gè)成份的表達(dá)在肝再生后期出現(xiàn)顯著差異,結(jié)合文獻(xiàn)分析,我們推測其可能參與調(diào)節(jié)肝再生終止和組織結(jié)構(gòu)的重塑。因此,我們首先用real-time PCR對(duì)這些基因的表達(dá)進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在肝再生過程中,血漿高分子量激肽原水平顯著升高,在肝再

13、生后期,激肽釋放酶表達(dá)增高。這兩者的同時(shí)增高意味著在肝再生后期產(chǎn)生了高濃度的活性物質(zhì)緩激肽和HKα。同時(shí),緩激肽和HKα的下游信號(hào)分子bEGF和tropomyosin等在肝再生后期均出現(xiàn)明顯的差異表達(dá),而NO含量在肝再生后期升高(第三部分)。通過這些研究結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)分析,我們推測在肝再生后期,緩激肽和HKα分別通過各自的信號(hào)途徑發(fā)揮促進(jìn)凋亡活性增高的作用。 2.激肽釋放酶激肽系統(tǒng)在肝再生過程中作用的研究 為進(jìn)一步驗(yàn)證緩

14、激肽在肝再生后期凋亡激活過程中的作用,我們采用具有特異性抑制緩激肽降解的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利處理動(dòng)物,觀察其對(duì)肝再生過程中細(xì)胞凋亡活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)用卡托普利可增加肝再生后期凋亡酶caspase的活性并加劇氧化應(yīng)激。這些結(jié)果說明,在肝再生后期,濃度增高的緩激肽可能通過NO等分子介導(dǎo)的信號(hào)途徑參與凋亡酶的激活,并進(jìn)一步參與調(diào)控肝再生的終止及肝臟組織結(jié)構(gòu)的重塑。 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究小結(jié)如下： 1.在肝再

15、生的早期(3h)和后期(7d-9d),細(xì)胞凋亡活性顯著增高。早期細(xì)胞凋亡活性的短暫性升高可能與術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。而在肝再生后期,顯著且持續(xù)增高的凋亡活性與應(yīng)激反應(yīng)無關(guān),可能參與促進(jìn)再生的終止和組織結(jié)構(gòu)的重塑。外源性途徑和內(nèi)源性途徑均可能參與凋亡酶的激活。 2.200余條凋亡相關(guān)基因參與肝再生的調(diào)控,其中包括KKS內(nèi)多個(gè)成分在內(nèi)的60余條基因可能參與促進(jìn)了肝再生后期凋亡活性的增高,并參與肝再生的終止及肝臟組織結(jié)構(gòu)的重塑。

16、3.線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放狀態(tài)對(duì)肝再生過程中凋亡酶的激活具有重要影響。在肝再生早期和后期,氧化應(yīng)激可能通過誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放參與促進(jìn)凋亡酶的激活,并進(jìn)一步參與再生終止和組織結(jié)構(gòu)重塑的調(diào)控。環(huán)孢菌素通過特異性抑制線粒體通透孔的開放抑制肝再生過程中凋亡活性的增高,同時(shí)氧自由基含量也有所下降。 4.枯否氏細(xì)胞介導(dǎo)的外源性途徑對(duì)肝再生過程中凋亡酶的激活具有重要影響。在肝再生后期,枯否氏細(xì)胞通過TNFα和caspase-8等介