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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:體外觀察不同濃度的同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)單用和聯(lián)用MgCl2對(duì)A7r5細(xì)胞增殖及其基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP-9)表達(dá)的影響,旨在進(jìn)一步探討 Hcy致動(dòng)脈粥樣硬化(artherosclerosis, AS)作用的分子機(jī)制及鎂劑治療的理論基礎(chǔ),為臨床防治AS提供可靠的實(shí)
2、驗(yàn)依據(jù)。
方法:⑴將不同濃度的Hcy與A7r5細(xì)胞體外共培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法檢測(cè)不同濃度的Hcy對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)不同濃度的Hcy對(duì)MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。⑵0.50mmol/L Hcy分別與不同濃度的MgCl2共同作用A7r5細(xì)胞48 h后
3、,細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MgCl2對(duì)Hcy誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖的影響;RT-PCR和Western blot法檢測(cè)不同濃度的MgCl2對(duì)Hcy誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果:⑴不同濃度的Hcy作用A7r5細(xì)胞48 h:①倒置顯微鏡下可見(jiàn),對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈紡錘狀,細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少,而實(shí)驗(yàn)組隨著Hcy濃度的升高,細(xì)胞數(shù)目逐漸增多,體積增大,生長(zhǎng)旺盛,呈增殖表現(xiàn);②細(xì)
4、胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,隨著 Hcy濃度增加,A7r5細(xì)胞數(shù)目增多,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異具有顯著性(P<0.05),表明Hcy能促進(jìn)A7r5細(xì)胞增殖;③MTT法結(jié)果顯示,隨著Hcy濃度增加,吸光度值逐漸增加,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,P<0.05;④細(xì)胞周期結(jié)果顯示,各濃度組 G1期細(xì)胞所占比例均低于對(duì)照組(P<0.05),而 S期細(xì)胞比例均高于對(duì)照組(P<0.05),表明Hcy能促使A7r5細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化,DNA合成增加;⑤RT-PCR結(jié)
5、果顯示,不同濃度Hcy處理組MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)逐漸增加,其相對(duì)值與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);⑥Western blot結(jié)果顯示,Hcy使A7r5細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)增加,各濃度組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);⑦RT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示正常對(duì)照組中 MMP-2表達(dá)多于 MMP-9,MMP-9表達(dá)較少,分別為(3.60±1.42)%、(1.60±0.
6、82)%。
⑵0.50mmol/L Hcy與不同濃度的MgCl2共同作用A7r5細(xì)胞48 h:①細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,A7r5細(xì)胞數(shù)目隨MgCl2濃度的不斷加大而減少,其中2.00、3.00mmol/L MgCl2組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);② MTT法結(jié)果顯示,隨著MgCl2濃度增加,吸光度值逐漸減少,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,P<0.05;③細(xì)胞周期結(jié)果顯示,MgCl2可抑制Hcy誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞從G1期向S期的
7、轉(zhuǎn)化,使S期細(xì)胞比例減少,DNA合成減少,其中2.00、3.00mmol/L MgCl2組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);④ RT-PCR結(jié)果顯示,MgCl2對(duì) Hcy誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)增加的效應(yīng)具有抑制作用,抑制作用隨MgCl2濃度增加而加強(qiáng),2.00、3.00mmol/L MgCl2組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);⑤Western blot結(jié)果顯示,MgCl2使Hcy誘導(dǎo)的A
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