生長因子聯合組織工程對骨髓來源間充質干細胞促增殖作用的分子影像研究.pdf

1、研究背景:
　　近年來，以干細胞為代表的再生醫(yī)學為多種終末期疾病的臨床再生治療帶來了新的希望。在心血管病、神經損傷修復、肝臟衰竭等多種危害人類健康的重大疾病的治療領域具有非常廣闊的應用前景。其中自體骨髓來源間充質干細胞(BMSCs)由于取材方便、體外擴增能力強、無免疫原性、不涉及倫理道德、基因轉染效率高等特點受到更多的關注，并獲得可喜成績。然而，作為“細胞藥物”的干細胞在單獨移植到體內受損部位后，均會不同程度地發(fā)生急性死亡和偏離目

2、標區(qū)域，極大影響B(tài)MSCs潛在的治療效果。
　　多種生物調節(jié)因子可以通過協調和引導各類細胞信號，促進干細胞的增殖和定向分化，其中主要包括堿性成纖維生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、血管生長因子（VEGF）等；此外，以基質膠（Matrigel）構建的三維骨架為載體，利用組織工程學方法進一步改善細胞生長的微環(huán)境，據報道可有利于移植細胞的存活和分化。但是，各種生長因子與基質膠的聯合應用是否對BMSCs產生協同效應

3、，目前仍然缺乏直接有力的研究依據。
　　干細胞在體存活的示蹤技術中，生物發(fā)光成像技術具有良好的準確性和可靠性，它主要利用熒光素酶和底物結合的高特異性，將活細胞獨有的化學能轉變成為可見光能，通過光子強度與標記細胞數目的正比關系，監(jiān)測干細胞體內外的增殖和存活情況。具有其他技術不可比擬的高靈敏度、高時間分辨率。
　　研究目的:
　　1.通過觀察不同生長因子（VEGF、bFGF、IGF-1）對BMSCs增殖和凋亡的影響，闡明生

4、長因子及Akt信號通路對BMSCs增殖和凋亡的作用；
　　2.通過報告基因成像技術活體動態(tài)長程觀察不同生長因子（VEGF、bFGF、IGF-1）聯合基質膠對BMSCs移植后體內存活增殖的作用,并初步探討其機制。
　　實驗方法:
　　第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響
　　1.分離培養(yǎng)-actin-lucFVB轉基因小鼠來源的BMSCs，并采用貼壁篩選法進一步純化，通過細胞表面標志

5、物（APC-CD90(+)、PE-CD44(+)、PE-CD34(-)和PE-CD45(-)）進行細胞流式分析鑒定；
　　2.培養(yǎng)至第3代的BMSCs，分別加入VEGF、bFGF、IGF-1(20ng/ml，72h)；利用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色實驗檢測各組BMSCs的增殖能力；TUNEL法染色實驗檢測各組BMSCs的體外凋亡情況；Western-blot方法檢測各組BMSCs中Akt及pAkt蛋白表達水平。
　　第二部

6、分：生長因子聯合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響
　　1.BMSCs分離培養(yǎng)鑒定方法同第一部分；
　　2.利用IVIS小動物活體成像系統(tǒng)觀察細胞數量與光學信號強度的關系，確定移植細胞數量
　　3.將既定移植細胞數量與20μl基質膠、20ng生長因子混合后，種植在-Actin-lucFVB轉基因小鼠的近交系小鼠背部皮下；利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察移植后既定時間點各組信號表達情況；
　　4.取第3周細胞移植

7、組織標本，TUNEL法檢測移植組織細胞凋亡情況；Western-blot方法檢測移植組織Akt及p-Akt蛋白表達水平。
　　結果:
　　第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響
　　1.通過細胞表面標志物鑒定確定所培養(yǎng)細胞為BMSCs；
　　2.MTT結果顯示，與對照組相比，bFGF（0.1051±0.01512％vs0.0671±0.01745％，P<0.05）；IGF-1（0.1

8、0436±0.01252％vs0.0671±0.01745％，P<0.05）均可明顯促進BMSCs增殖；
　　3.TUNEL結果顯示，與對照組相比，bFGF（44.0±2.0％vs56.0±3.7％，P<0.05）、IGF-1（36.3±3.2％vs56.0±3.7％，P<0.05）可以抑制BMSCs凋亡；
　　4.Western-blot結果顯示，對照組相比，B+bFGF組（0.47±0.0306vs0.28
　　±

9、0.0378，p<0.05）、B+IGF-1組（0.57±0.0200vs0.28±0.0378，p<0.05）的pAkt蛋白表達水平明顯增高。
　　第二部分：生長因子聯合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響
　　1.通過IVIS成像系統(tǒng)檢測，定量分析到Fluc的光學信號強度與細胞數量呈線性相關；
　　2.IVIS成像結果顯示，移植后第5周（B+M+I）組細胞存活率明顯高于其他實驗組（B+M+I：21％，其他組均

10、<10％）（p<0.05）；
　　3.TUNEL結果顯示，與對照組相比，B+M+b組(32.00±1.63％vs42.33±2.05％，P<0.05)，B+M+I組（26.66±1.69％vs42.33±2.05％，P<0.05）凋亡率明顯降低；
　　4.Western-blot結果顯示，與對照組相比，B+M+b組(0.49±0.032vs0.33±0.0153，p<0.05)和B+M+I組（0.63±0.025vs0.33