抗新城疫病毒繁殖的短肽及其突變體基因的克隆和在大腸桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、目的：化學(xué)合成抗新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽二串聯(lián)體(Nonapeptide2)基因及其突變體(Nonapeptide2-M)基因，分別在大腸桿菌中克隆和融合表達(dá)，為進(jìn)一步研究兩者的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的氨基酸序列，應(yīng)用大腸桿菌偏愛密碼子，設(shè)計(jì)抗NDV繁殖的九肽(Nonapeptide)二串聯(lián)體基因序列。對該九肽進(jìn)行改造，將6位賴氨酸置換為酪氨酸，同樣選擇大腸桿菌偏愛密碼子，得到其突變體基因。在基因兩端分別

2、加入限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位點(diǎn)，在相鄰Nonapeptide間加入了蛋氨酸密碼子，突變體同Nonapeptide加入蛋氨酸密碼子，化學(xué)合成該九肽二串聯(lián)體基因(Nonapeptide2)及其突變體基因(Nonapeptide2-M)。將Nonapeptide2、Nonapeptide2-M分別與經(jīng)EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切后的克隆載體pUC18連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑取陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒，酶切、

3、PCR鑒定并測序。酶切克隆重組體得到目的基因，與經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定并測序。將鑒定為陽性的茵落用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白2-5小時(shí)，SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)結(jié)果。收集含融合蛋白的大腸桿菌BL21，使用GST融合蛋白純化試劑盒裂解包涵體，純化融合蛋白，用凝血酶對融合蛋白進(jìn)行切割分離。 結(jié)果： 1、分別將Nonape

4、ptide2、Nonapeptide2-M克隆到載體pUC18上，初步檢測、篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并測序，結(jié)果表明與預(yù)先設(shè)計(jì)的Nonapeptide2、Nonapeptide2-M基因序列一致，克隆重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、構(gòu)建了融合表達(dá)載體pGEX-4T-1與Nonapeptide2、Nonapeptide2-M重組質(zhì)粒，初步檢測、篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步測序正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 3、Nonapeptide2、Nonapep

5、tide2-M插入表達(dá)載體pGEX-4T-1后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2-5h，SDS-PAGE電泳結(jié)果可見約29KD的融合蛋白條帶.說明兩條目的基因得到融合表達(dá)。 4、收集分別含Nonapeptide2融合蛋白、Nonapeptide2-M融合蛋白的大腸桿菌BL21，使用GST融合蛋白純化試劑盒裂解包涵體，純化、溶解融合蛋白，用凝血酶切割融合蛋白，初步得到分別含Nonapeptide2蛋白及突變體Nonapeptide2-M蛋白的