SPARC對(duì)造血發(fā)育的影響及機(jī)理研究.pdf

1、目前關(guān)于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)的功能研究主要集中在對(duì)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響，而對(duì)造血發(fā)育影響的研究較少。5q-骨髓增生異常綜合征(5q-MDS)患者骨髓細(xì)胞中SPARC的表達(dá)水平降低;免疫調(diào)節(jié)劑lenalidomide治療5q-MDS患者，能抑制惡性幼紅細(xì)胞的增殖，同時(shí)SPARC的表達(dá)上調(diào)。此外，SPARC缺失小鼠對(duì)脂多糖(LPS)刺激的反應(yīng)降低，并且骨髓中CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，提示SPARC可能參與調(diào)節(jié)

2、紅細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育。本研究以SPARC缺失小鼠為研究對(duì)象，研究SPARC在紅細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞發(fā)育中的作用。本研究包括三部分，分述如下:
　　第一章SPARC在紅細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及機(jī)理研究
　　目的:分析SPARC缺失小鼠體內(nèi)紅細(xì)胞的發(fā)育，并探討SPARC影響紅細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理;研究SPARC蛋白對(duì)人紅細(xì)胞發(fā)育的影響。方法:采用血液分析儀，流式細(xì)胞技術(shù)，體外集落培養(yǎng)和骨髓移植技術(shù)，分析SPARC缺失小鼠體內(nèi)紅細(xì)胞的發(fā)育

3、;采用磁珠分選臍血CD34+細(xì)胞，體外集落培養(yǎng)和體外紅細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)，研究SPARC蛋白對(duì)人紅細(xì)胞發(fā)育的影響。結(jié)果:1、SPARC缺失小鼠外周血中紅細(xì)胞數(shù)量和骨髓中Ter119+細(xì)胞含量未見明顯改變，但是SPARC缺失型骨髓細(xì)胞(BMCs)形成爆發(fā)式紅系集落形成單位(BFU-E)和脾臟集落形成單位(CFU-S8)的數(shù)量減少，說明SPARC缺失小鼠體內(nèi)紅系祖細(xì)胞發(fā)育受損。2、體外長期培養(yǎng)SPARC缺失型BMCs，形成BFU-E的數(shù)量減少

4、;骨髓移植結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPARC缺失不影響造血細(xì)胞本身的紅系分化潛能，而是導(dǎo)致造血微環(huán)境支持紅系祖細(xì)胞發(fā)育的能力受損。3、SPARC蛋白促進(jìn)臍血CD34+細(xì)胞形成BFU-E和紅系集落形成單位(CFU-E)，還促進(jìn)CD34+細(xì)胞向紅細(xì)胞分化過程中血紅蛋白的合成，但不影響CD71+ GPA-和CD71+ GPA+細(xì)胞的生成。結(jié)論:SPARC促進(jìn)紅系祖細(xì)胞發(fā)育，但不影響紅細(xì)胞終末分化。
　　第二章 SPARC在B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及

5、機(jī)理研究
　　目的:分析SPARC缺失小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育，并探討SPARC影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理。方法:采用流式細(xì)胞技術(shù)，骨髓移植技術(shù)，體外B淋巴細(xì)胞分化，細(xì)胞增殖和凋亡分析技術(shù)，研究SPARC缺失對(duì)B淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響;Real-time RT-PCR，Westernblotting和基因芯片技術(shù)，研究SPARC影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理。結(jié)果:1、SPARC缺失小鼠外周血中B淋巴細(xì)胞含量增加，而骨髓中pro-B，pre-

6、B和不成熟B細(xì)胞減少。2、SPARC缺失小鼠骨髓中Lineage-Sca-1+c-kit+(LSK)細(xì)胞含量減少;骨髓移植結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPARC缺失不影響造血細(xì)胞本身的B淋巴細(xì)胞分化潛能，但改變了造血微環(huán)境支持B淋巴細(xì)胞發(fā)育的能力。3、SPARC缺失型骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)抑制B淋巴細(xì)胞的分化;野生型BMSCs表達(dá)SPARC，但是SPARC蛋白并不能促進(jìn)SPARC缺失型BMSCs支持B淋巴細(xì)胞分化。4、SPARC缺失不影響IL-7和S

7、DF-1的表達(dá)，但是SPARC缺失型BMSCs條件培養(yǎng)液能抑制B淋巴細(xì)胞的分化，說明該條件培養(yǎng)液中含有可溶性抑制因子;基因芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpina3n）和金屬蛋白酶9(MMP9)在SPARC缺失型BMSCs中表達(dá)上調(diào)，但均不是影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育的原因。結(jié)論:SPARC缺失小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙，但SPARC蛋白對(duì)B淋巴細(xì)胞發(fā)育無直接作用，而是通過影響B(tài)MSCs分泌可溶性抑制因子，間接調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育。

8、
　　第三章脂肪細(xì)胞影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育的初步研究
　　目的:SPARC缺失小鼠骨髓中脂肪細(xì)胞增多，而后者負(fù)性調(diào)控造血細(xì)胞的發(fā)育。我們推測，增多的脂肪細(xì)胞可能是SPARC缺失小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙的另一個(gè)原因。本章節(jié)我們研究了脂肪細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的影響。方法:將OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，與C57/BL小鼠BMCs共培養(yǎng)，以研究脂肪細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞分化的影響。結(jié)果:1、OP9細(xì)胞能快速、有效地分化為脂肪細(xì)胞，表達(dá)白色脂肪