球藥隔重樓甾體皂甙生物合成相關(guān)功能基因的克隆與組織表達分析.pdf

1、甾體皂甙是一類藥用價值較高的次生代謝產(chǎn)物，探索和研究它的合成途徑，并實現(xiàn)其代謝調(diào)控，對促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展具有重大意義。球藥隔重樓(Paris fargesii Franch)是百合科重樓屬的一種，它具有清熱解毒、止血、止痛的功效，主要藥效成分是甾體皂甙。甾體皂甙是通過甲羥戊酸途徑合成的，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是該途徑的第一個限速酶。
　　 本論文首次成功提取了球藥隔重樓的總RNA，通過比對其他種屬H

2、MGR基因，找出它們的同源保守序列，擴增出目的基因的保守片段、3’和5’cDNA拼接，克隆得到了HMGR的全長cDNA，命名為PfHMGR，大小為1973 bp，編碼576個氨基酸。PfHMGR的生物信息學(xué)分析顯示，其蛋白分子量約為61 kDa，理論等電點為6.64，與其他植物的HMGR基因具有較高的同源性，有兩個HMG-CoA結(jié)合位點和兩個NADP(H)結(jié)合位點，包括兩個跨膜區(qū)域和三個催化區(qū)域。
　　 本論文首次構(gòu)建了PfHM

3、GR基因的大腸桿菌表達載體并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達，其表達鑒定結(jié)果顯示PfHMGR能夠替代AtIPI基因的功能，促進了類胡蘿卜素的積累，即PfHMGR在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達。
　　 以18S基因作為內(nèi)參照，采用Real-time PCR方法擴增了甾體皂甙的生物合成途徑中其他三個功能基因IPPI、FPS、SS的部分序列，研究了它們在不同組織中的表達差異，結(jié)果顯示這三個基因在根、莖、葉中均有表達。IPPI在莖中的表達量最高，根中最