木豆葉提取物對雌激素缺乏性骨丟失的影響.pdf

1、目的：觀察木豆葉提取物對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠，HOS-TE85成骨細胞功能，礦化及破骨細胞分化的影響，從而探討植物雌激素木豆葉提取物對更年期由于雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松的抑制作用。 方法：1)動物實驗：雌性Wistar大鼠60只，體重232.7±11.0g。去除成年雌性大鼠雙側(cè)卵巢造成骨丟失型骨質(zhì)疏松模型。動物分成6組：①假手術(shù)對照組(n=8)；②骨質(zhì)疏松模型組；③雌二醇組(0.5mg/kg)；④木豆葉提取物32-1低劑量組(

2、50mg/kg)；⑤木豆葉提取物32-1中劑量組(100mg/kg)；⑥木豆葉提取物32-1高劑量組(200mg/kg)。假手術(shù)組和模型組大鼠給予去離子水1ml/100g體重。大鼠卵巢切除兩周后，開始給予木豆葉提取物或雌二醇或去離子水，灌胃1次/天，6天/周，連續(xù)8周。測定指標：體重、子宮重量和血清激素水平、骨病理切片檢查，HE染色法觀察股骨病理改變(骨小梁結(jié)構(gòu)改變)。 2)細胞實驗：Ⅰ木豆葉對HOS-TE85成骨細胞功能的影響

3、：將細胞種于板中，第二天加藥，E2(10-9M)，木豆葉提取物(10-7，10-8，10-9g/ml)藥物處理48h后，分別觀察以下指標①細胞增殖(MTT)；②3H-脯氨酸摻入；③堿性磷酸酶活性。 Ⅱ木豆葉(10-8g/ml)長時程作用HOSTE85成骨細胞18天后，去培養(yǎng)基，用福爾馬林/甲醇/水固定。茜素紅(AlizarinRedS，PH4.0)染色，用去離子水洗，晾干。顯微鏡下觀察照相。茜素紅染色以觀察木豆葉對成骨細胞間質(zhì)礦

4、化的影響。 Ⅲ木豆葉對破骨細胞形成的影響：處死大鼠，無菌下取股骨分離周圍組織，切斷股骨兩端骨骺，D-Hanks沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心，加入預先配好的培養(yǎng)體系DMEM誘導培養(yǎng)基[20％FCS，1.25ng/mlGM-CSF，10-8M1,25(OH)2VD3.]分別加入E2(10-9M)，2木豆葉(10-7，10-8，10-9g/ml)觀察每天細胞被誘導情況。6天后進行抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色，照相，并進行破骨細胞計數(shù)

5、(以TRAP陽性，胞核3個以上為標準)，觀察藥物對破骨細胞分化的影響。 結(jié)果：1)動物實驗：①體重與子宮重量變化：造模后，大鼠體重明顯增加。給予雌二醇和木豆葉提取物大鼠體重較模型組略有降低。模型組子宮重量僅是假手術(shù)組的20％。而給予雌二醇后，大鼠子宮重量增加了108.3％。木豆葉各劑量組大鼠的子宮重量沒有明顯增加(表6)；②激素水平變化：大鼠卵巢切除后，血清雌二醇含量明顯下降，F(xiàn)SH和LH則明顯增加。而給予雌二醇后，血清雌二醇含

6、量增加57.7％，F(xiàn)SH降低11.5％，LH降低20.7％。木豆葉高劑量組血清雌二醇含量沒有明顯增加，F(xiàn)SH和LH則分別降低11.5％和15.2％。本實驗結(jié)果表明，木豆葉改善由于血清雌激素水平降低所引起的FSH和LH的升高(表7)，具有雌激素樣作用；③骨小梁：去卵巢后，大鼠的股骨無一例外的出現(xiàn)骨丟失，表現(xiàn)為骨小梁變細，期間連接較少，小梁間隙增大，面積減少。補充雌二醇后，有82％大鼠股骨的骨丟失得到了恢復。木豆葉提取物高劑量組大鼠則有60

7、％的股骨的骨丟失得到改善，中劑量組30％骨丟失有所改善(表8和圖4)。表現(xiàn)為，木豆葉提取物高劑量組：骨小梁無明顯變細，且排列較整齊，連接成網(wǎng)，局部區(qū)域骨小梁間隙略增大，骨小梁面積均未見減少。雌二醇組：骨小梁無明顯變細，排列整齊，骨小梁面積無明顯減少。2)細胞實驗：Ⅰ對HOSTE85成骨細胞的影響：①細胞增殖(MTT)：木豆葉提取物，48小時作用成骨細胞，No.29-1，30，32-1，35-1，35-2，35-3，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅵ號成分可

8、劑量依賴的促進細胞的增殖，細胞數(shù)量較對照組增加23％-73％；②3H-脯氨酸摻入：No.29-1，29-2，30，31-1，31-2，32-1，35-2，35-3，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ號成分均能促進3H-脯氨酸摻入。其中，化合物No.31-2，32-1作用下，摻入量增加128％。脯氨酸是膠原蛋白形成的必要氨基酸之一。脯氨酸摻入量的增加說明木豆葉提取物刺激細胞膠原蛋白形成；③堿性磷酸酶活性：No.35-1，35-3，Ⅱ，3Ⅲ，Ⅵ號成分對堿性磷酸

9、酶的活性有增強作用，P＜0.01。堿性磷酸酶是骨形成所必需的酶。實驗結(jié)果說明木豆葉可促進成骨細胞的功能。(見表1，2，3)。 Ⅱ木豆葉提取物No.31-1，31-2，32-1，35-3對成骨細胞18天作用后，礦化面積明顯增大，說明這些木豆葉成分的長時程(18天)作用對HOSTE85成骨細胞的礦化起著明顯的促進。礦化面積的增大是木豆葉提取物促進成骨細胞增殖，膠原蛋白形成，增加堿性磷酸酶活性，細胞成熟，以及進一步促進問質(zhì)礦化共同作用

10、的結(jié)果。 Ⅲ木豆葉對破骨細胞形成的影響：細胞接種后，于倒置顯微鏡下觀察，第6天，破骨細胞形成最多，細胞形狀為圓形，橢圓形，梭形，及不規(guī)則形狀，胞核達3～6個，有的出現(xiàn)偽足。酸性磷酸酶染色后，破骨細胞計數(shù)?？梢娚檐眨?2-1，35-1，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ在10-8g/ml時抑制率均在20％以上。No.29-2，31-1，31-2在10-7g/ml藥物濃度時抑制率均在20％以上?？梢?，木豆葉提取物對破骨細胞生成的具有抑制作用，從而抑制骨質(zhì)