新型抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻材料創(chuàng)制.pdf

1、水稻（Oryza sativa L）是我國(guó)最重要的糧食作物，全國(guó)約有近65％的人口以稻米為主食。田間雜草在水稻的生產(chǎn)種植過(guò)程中危害嚴(yán)重，破壞水稻品質(zhì)，造成水稻減產(chǎn)。施用化學(xué)藥劑除草是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。草甘膦由于其高效、低毒、低殘留、非選擇性、殺草廣譜性而成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使用面積最廣、銷量最大的除草劑。但由于草甘膦是非選擇性除草劑，直接在農(nóng)田使用會(huì)殺死雜草的同時(shí)對(duì)水稻也產(chǎn)生嚴(yán)重藥害。因此培育抗草甘膦水稻可以擴(kuò)大草甘膦的施用范

2、圍，避免草甘膦對(duì)水稻的危害，同時(shí)對(duì)提高水稻產(chǎn)量、改革耕作制度都具有重要意義。
　　研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)，抗性基因在莖尖部位的表達(dá)量不高，如果噴施草甘膦的時(shí)期以及噴施藥量控制不當(dāng)，容易出現(xiàn)花器官發(fā)育延遲甚至出現(xiàn)致畸致死現(xiàn)象，影響結(jié)實(shí)。因此培育出花發(fā)育時(shí)期在分生組織高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻是解決抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻實(shí)用化的關(guān)鍵。
　　本研究以轉(zhuǎn)EpspsM突變基因水稻高代純合株系E6P14為材料，比較

3、了不同施藥時(shí)期施藥后轉(zhuǎn)基因株系的田間抗性和產(chǎn)量，總結(jié)出轉(zhuǎn)基因水稻的E6P14草甘膦耐受濃度和安全用藥時(shí)期。利用同源克隆技術(shù)從擬南芥中分離了莖尖特異性啟動(dòng)子Lfy，從水稻中分離了花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子Rfl；并驗(yàn)證了這2個(gè)啟動(dòng)子對(duì)基因特異性表達(dá)的調(diào)控模式；構(gòu)建了5個(gè)植物表達(dá)載體pCLfyGUS、pCAMBIA1300-Lfy-OsEpspsM、pCAMBIA1300-Ubi-OsEpspsM和pCBIAM1300-Lfy-OsEpspsM-

4、Ubi-OsEpspsM、pCRflGUS，轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻。分析了特異性啟動(dòng)子Lfy、Rfl在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)部位，及其驅(qū)動(dòng)外源基因OsEpspsM的能力。研究結(jié)果如下：
　　1.播種后45天噴草甘膦（濃度為商品推薦使用濃度的3倍），轉(zhuǎn)基因水稻E6P14平均單株產(chǎn)量為27.26±0.76g，與不噴藥對(duì)照以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諞]有顯著性差異；播種后55天噴藥，E6P14平均單株產(chǎn)量為22.95±1.78g，與不噴藥對(duì)照（28.42±

5、2.8g）及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?6.34±0.21g）相比，產(chǎn)量顯著降低。上述結(jié)果說(shuō)明，播種后的45天內(nèi)噴施草甘膦不影響轉(zhuǎn)基因水稻的正常結(jié)實(shí)；而在播種后的45-55天影響，此時(shí)水稻即將或者開始進(jìn)入幼穗分化，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦敏感，不宜再噴施。
　　2.克隆了擬南芥莖尖特異性啟動(dòng)子Lfy，全長(zhǎng)2001bp，在翻譯起始密碼子的-100～108處有TATA–box；還含有4個(gè)具有增強(qiáng)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用的CAAT-box；此外還有很多與光反應(yīng)

6、有關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)，如GATA-基序、GAG-基序、TCT-基序以及GA-基序等。構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCLfyGUS，獲得轉(zhuǎn)基因水稻42株陽(yáng)性克隆，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和Q-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證了Lfy啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在水稻穎花分化后期的幼穗中特異表達(dá)。構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-Lfy-OsEpspsM和pCAMBIA1300-Lfy-OsEpspsM-Ubi-OsEpspsM并轉(zhuǎn)化水稻，分別獲得24株、61

7、株陽(yáng)性克隆。通過(guò)田間抗性分析及噴藥前后莽草酸含量變化，結(jié)果表明：雙價(jià)載體pCAMBIA1300-Lfy-OsEpspsM-Ubi-OsEpspsM轉(zhuǎn)基因水稻幼穗能夠耐受高于13%商業(yè)推薦施用濃度3倍的草甘膦濃度。
　　3.克隆了水稻花器官發(fā)育特異啟動(dòng)子Rfl全長(zhǎng)，該啟動(dòng)子全長(zhǎng)2001bp。序列分析發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)：TATA-box；以及增強(qiáng)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用的CCAAT-box；另外還有一些與花器官發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元