加味四逆散抗DHBV 3TC耐藥株和抗炎、抗脂質(zhì)過氧化作用的實驗研究.pdf

1、1.研究目的 通過體內(nèi)外實驗研究，了解加味四逆散抗HBV和DHBV3TC耐藥株的作用，以及對免疫性肝損傷的抗炎、抗脂質(zhì)過氧化作用，以期探索加味四逆散治療慢性乙型肝炎及抑制免疫性肝損傷的作用機制和靶點，為臨床廣泛應用提供科學的依據(jù)。 2.實驗內(nèi)容 2.1四逆散加減方體內(nèi)抗DHBV的實驗研究 2.2加味四逆散體內(nèi)抗DHBV的實驗研究 2.3DHBV3TC耐藥株的檢測 2.4加味四逆散體內(nèi)抗DH

2、BV3TC耐藥株的實驗研究 2.5加味四逆散體外抗HBV的實驗研究 2.6加味四逆散對小鼠的急性毒性試驗 2.7加味四逆散對ConA所致免疫性肝損傷小鼠的保護作用 2.8加味四逆散對BCG+LPS所致免疫性肝損傷小鼠的保護作用 3.實驗方法 3.1將先天感染鴨隨機分為5組，每組6只。分別為病毒對照組，3TC組，原方組，加味組，去枳組。各組中藥醇提物均以20g·kg-1·d-1灌胃；3TC按

3、200mg·kg-1d-1灌胃，共10d。對照組未做處理。分別于T0、T5、T10、P3各時間點采血，分離血清，用斑點雜交法測定血清中DHBV的載量變化。 3.2將先天感染鴨隨機分為5組，每組6只。分別為病毒對照組，3TC組，加味四逆散大，中，小劑量組。加味四逆散醇提物分別以20g·kg-1·d-1、10·kg-1·d-1、5g·kg-1·d-1灌胃；3TC按200mg·kg-1d-1灌胃，共10d。對照組未做處理。分別于T0、

4、T5、T10、P3各時間點采血，分離血清，用斑點雜交法測定血清中DHBV的載量變化。 3.33份DHBV陽性血清分別取自2只先天攜帶DHBV的廣東麻鴨和3TC耐藥的廣州麻鴨。提取DHBVDNA。使用一對擴增DHBVDNA全基因序列的引物，用PCR法擴增全基因序列，取PCR產(chǎn)物10μl進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線檢測儀下觀測結(jié)果。 3.41日齡廣州麻鴨，足靜脈注射DHBVDNA3TC耐藥株血清，斑點雜交篩選出后天感染

5、DHBV者作為實驗動物。動物感染毒種13天后，隨機分為6組，每組5-6只。分別為病毒對照組，3TC組，ADV組，加味四逆散大，中，小劑量組。加味四逆散醇提物分別以20g·kg-1·d-1、10·kg-1·d-1、5g·kg-1·d-1灌胃；3TC按200mg·kg-1·d-1灌胃，ADV按100mg·kg-1·d-1灌胃，共10d。對照組未做處理。分別于T0、T5、T10、P3各時間點采血，分離血清，用斑點雜交法測定血清中DHBV的載量

6、變化。 3.5用2.2.15細胞作為細胞模型，將加味四逆散藥物原液倍比稀釋成7個濃度上藥。同時設無藥物細胞對照。上藥8d后收集上清用ELISA法測定HBsAg、HBeAg。并用MTT法檢測藥物細胞毒性，計算藥物對抗原的半數(shù)抑制濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。3.6NIH小鼠隨機分為5組，每組10只。各組劑量分別為160g·kg-1·d-1，80g·kg-1·d-1，40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·

7、kg-1·d-1(相當60kg體重的成人每日每公斤用藥量的80倍、40倍、20倍、10倍和5倍劑量)。動物禁食16h后一次灌胃給予受試物，觀察14d，記錄動物中毒表現(xiàn)及死亡情況，后斷頭處死動物。 3.7以ConA所致肝損傷小鼠為動物模型，隨機分為正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、加味四逆散大、中、小劑量組；造模后正常對照組及模型組均灌胃生理鹽水0.2ml/只/次，聯(lián)苯雙酯組灌胃聯(lián)苯雙酯，150mg·kg-1·d-1，加味四逆散

8、大、中、小劑量組分別灌胃加味四逆散40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·kg-1·d-1。用藥三次后摘眼球采血分離血清檢測ALT、AST；IFN-γ、TNF-α；SOD、MDA和NO。斷頭處死動物，肝臟用10％中性甲醛溶液固定，HE染色，光鏡病理觀察。采用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。 3.8采用BCG+LPS所致肝損傷小鼠為動物模型。動物隨機分為正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、加味四逆散大、中、

9、小劑量組；造模后第一天起灌胃。正常對照組及模型組均灌胃生理鹽水0.2ml/只/次，聯(lián)苯雙酯組灌胃聯(lián)苯雙酯，150mg·kg-1·d-1，加味四逆散大、中、小劑量組分別灌胃加味四逆散40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·kg-1·d-1。各組均每天灌胃1次，共10天。摘眼球采血分離血清檢測ALT、AST；IL-6、TNF-α；SOD、MDA和NO。斷頭處死動物，肝臟用10％中性甲醛溶液固定，HE染色，光鏡病理觀察。采

10、用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。 4.實驗結(jié)果 4.1四逆散加味方組在用藥第10天時病毒滴度顯著下降，但在停藥第3天，血清病毒滴度又有回升，提示加味方在體內(nèi)有抑制DHBV作用。而四逆散原方和四逆散去枳實方DHBV滴度無下降，提示枳實是四逆散重要的組成部分。3TC組在給藥第5天和給藥第10天時血清病毒滴度均顯著下降，但停藥3天時也有明顯回升。本實驗結(jié)果提示了，四逆散加用健脾、祛濕中藥可起到抗DHBV的作用。

11、4.2加味四逆散大劑量組在用藥第5天起DHBVDNA含量降低，用藥第10天DHBVDNA仍在較低水平，但停藥第后3天開始病毒滴度回升；中、小劑量組在整個用藥過程中病毒滴度均無明顯下降。3TC組在給藥第5天和給藥第10天時血清病毒滴度均顯著下降，但停藥3天時也有明顯回升。 4.3經(jīng)DHBVDNA提取并進行PCR擴增后，三組血清DHBVDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，均可擴增出大小約3.0kb的片段，與預期相符。 4

12、.4ADV組在給藥第5天、第10天血清DHBVDNA含量下降，停藥后3天病毒滴度仍保持在較低的水平，但與自身用藥前比較無統(tǒng)計學差異，說明病毒滴度已經(jīng)開始回升。提示ADV對DHBV3TC耐藥株具有抗病毒作用但和3TC等其它核苷類病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑一樣，存在停藥后可能出現(xiàn)病毒滴度的回升的缺點。而大劑量的加味四逆散雖可抑制DHBV，但對3TC耐藥株未見有抑制作用，然而從實驗結(jié)果可以看出，動物體內(nèi)的DHBVDAN滴度隨著用藥時間的延長具有下降的

13、趨勢，這提示我們加味四逆散可能具有抗3TC耐藥的功效。由于中藥一般起效較慢，所以這有待于今后延長用藥時間、或者是調(diào)整藥物劑量或藥物組成后進一步探討。 4.5加味四逆散對2.2.15細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為＞200mg/ml。對HBsAg，HBeAg的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為＜3.12mg/ml和43.68mg/ml；治療指數(shù)(TI)分別為＞64.12和＞4.58。 4.6給藥后動物一般狀況良好，毛色正常，體

14、重增長，飲食、排便及活動等未見異常，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應，未見動物死亡。 4.7加味四逆散大、中劑量組ALT、AST降低、肝組織病理變化減輕；加味四逆散治療組血清IFN-γ、TNF-a含量明顯低于模型組，表明加味四逆散可通過抑制T淋巴細胞活化和IFN-γ、TNF-a的釋放而發(fā)揮抗肝損傷作用。而加味四逆散大、中劑量組均能明顯升高ConA所致肝損傷小鼠肝組織SOD的活力，降低MDA和NO的含量。 4.8加味四逆散大、中劑量組

15、ALT、AST降低、肝組織病理變化減輕；其中加味四逆散大劑量組血清IL-6、TNF-a含量明顯低于模型組，表明加味四逆散也可通過抑制T淋巴細胞活化和IL-6、TNF-a的釋放而發(fā)揮抗肝損傷作用。同時加味四逆散大、中劑量組均能明顯升高BCG+LPS所致肝損傷小鼠肝組織SOD的活力，降低MDA和NO的含量。 5.創(chuàng)新點 5.1以DHBV3TC耐藥株強陽性血清為毒種，感染1日齡雛鴨造模成后天感染3TC耐藥鴨乙型肝炎模型，進行體

16、內(nèi)抗3TC耐藥株的實驗研究，且造模成功。 5.2鴨乙型肝炎動物體內(nèi)實驗提示阿德福韋對DHBV3TC耐藥株具有抗病毒作用，與臨床ADV用于治療3TC耐藥病人有效的報道一致。 5.3在方法上首次將中醫(yī)治法方藥用于干預3TC耐藥株，進行了體內(nèi)實驗研究，其治法為疏肝健脾，清熱祛濕，與前人所用之補腎、活血、清熱解毒、疏肝理氣等組方原則相比具有獨特之處，且組方方面加入了廣東草藥雞骨草，為嶺南特色草藥的現(xiàn)代藥理研究增加了新的內(nèi)容。

17、 5.4通過體內(nèi)實驗，初步提示加味四逆散保護免疫性肝損傷的機制與其抗脂質(zhì)過氧化及抑制NO的產(chǎn)生和降低IFN-γ，TNF-a、IL-6等炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。 6.結(jié)論 6.120g·kg-1·d-1加味四逆散具有體內(nèi)抗鴨乙型肝炎病毒的作用。阿德福韋對DHBV3TC耐藥株具有抗病毒作用，與臨床ADV用于治療3TC耐藥病人有效的報道一致。而加味四逆散抗3TC耐藥株的療效不明確。體外實驗提示加味四逆散對2.2.15細胞分泌的H