利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)血管瘤中VEGF基因的表達(dá)對血管瘤影響的實驗研究.pdf

1、血管瘤是嬰幼兒最常見的皮膚腫瘤，好發(fā)于頭面部和四肢等體表部位，是以血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為主的良性腫瘤。其特點是在嬰幼兒出生后第1年迅速增長，在隨后的7-9年緩慢消退。一般將其分為增殖期、消退期和消退后期3個階段。其中相當(dāng)一部分血管瘤可以自然消退，不留下任何后遺癥；還有部分血管瘤可能破潰感染留下瘢痕，大約20％血管瘤會破壞正常組織甚至危及生命。但是其發(fā)病機理和消退機制到目前還不清楚。因此血管瘤的治療方法有很多，但是療效卻不確切。研究其發(fā)病機制

2、不僅能夠預(yù)防血管瘤的發(fā)生，同時也有助于臨床的治療。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)，有助于血管生成的因子有：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、雌二醇（oestradiol）、成纖維生長因子（FGF）、血管生長素（angiogenin）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、α-腫瘤壞死因子（TNF-α）、血小板衍生生長因子（PDGF）、白介素-8（IL-8）等。其中VEGF被認(rèn)為與血管瘤的生成、發(fā)展和消退有著重要的聯(lián)系。VEGF具有促進(jìn)血管化、維持內(nèi)皮細(xì)胞的

3、活性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加微血管通透性等特性。它是內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cell，ECs）的特異性有絲分裂原，能選擇性的作用于EC，促進(jìn)其增殖、遷移，有利于血管生成。在腫瘤、缺血缺氧等情況下，VEGF及其受體呈高表達(dá)。而VEGF不足時會導(dǎo)致血管管腔閉合、血管退化。
　　目前利用基因干擾技術(shù)下調(diào)VEGF的表達(dá)在研究與治療腫瘤方面取得了極大的進(jìn)展。同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)增殖性血管瘤（嬰幼兒血管瘤，IH）不同

4、于其它類型的血管畸形，其早期迅速的擴張是血管內(nèi)皮細(xì)胞的非控性增生，這些增生是血管形成刺激因子或抑制因子水平異常引起的。其中VEGF被認(rèn)為在這種血管瘤的形成中起十分重要的作用。將VEGF作為一種新的治療靶點，已部分應(yīng)用到血管瘤的臨床診斷和治療中。
　　本課題擬利用基因干擾技術(shù)，通過體內(nèi)和體外實驗研究，下調(diào)血管瘤動物模型和嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，觀察血管瘤和血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)展變化，同時探討血管瘤的增殖和消退機制

5、。為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　1.裸鼠血管瘤移植模型的建立
　　目的：建立人毛細(xì)血管瘤裸鼠移植模型，探討血管瘤裸鼠模型建立的最佳條件。
　　方法：將手術(shù)切除的雌激素受體陽性的兒童增生期血管瘤組織制成組織塊，植入20只裸鼠(BALB/c nude mice)皮下，每只4處，將20只裸鼠分為4個實驗組。實驗1組在移植后給予普通鼠食喂養(yǎng)；實驗2組在1組基礎(chǔ)上每周肌注雌二醇0.01mg；實驗3組在1組基礎(chǔ)上每周肌注

6、雌二醇0.1mg；實驗4組在1組基礎(chǔ)上每周肌注雌二醇1mg，于移植后第30、60、90天切取移植瘤。移植瘤標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)光鏡檢查，用血管內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體CD31、CD34、Ki-67行免疫組化染色。
　　結(jié)果：移植后早期各組標(biāo)本內(nèi)皮細(xì)胞大量變性、壞死，30d后，單純喂養(yǎng)的實驗1組及實驗2組部分移植瘤開始吸收或形成膿腫及纖維化。實驗3、4組移植瘤開始緩慢生長。90d后實驗1組實驗2組移植瘤均未成活，實驗4組移植瘤部分成活，而實驗3

7、組移植瘤全部成活。光鏡下成活的移植瘤與原血管瘤組織生物學(xué)特點相似。
　　結(jié)論：不同劑量的雌激素對血管瘤裸鼠移植模型的建立有一定影響，適量的應(yīng)用雌激素可建立穩(wěn)定的人血管瘤裸鼠移植動物模型。該模型可以應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床的血管瘤研究。
　　2.增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外培養(yǎng)和鑒定血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（Hemangioma endothelial cell，HemEC）。
　　方法：無菌條件下手術(shù)切取增生期

8、血管瘤組織標(biāo)本，利用組織塊法進(jìn)行培養(yǎng)。用含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)基，加入內(nèi)皮細(xì)胞生長支持物(Endothelial cell growth supplement，ECGS，濃度為100μg/ml）在含5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩到三天換液，細(xì)胞鋪滿瓶底后傳代。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，并用免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原和透射電鏡檢測鑒定細(xì)胞。
　　結(jié)果：組織塊接種3天后有細(xì)胞開始從邊緣移出，細(xì)胞成

9、多角形，1周左右混合成片，部分匯合成島狀。大約3周可以鋪滿瓶底，隨后消化傳代。傳代細(xì)胞成典型的“鵝卵石”樣排列鋪滿瓶底。細(xì)胞Ⅷ因子染色為陽性，透射電鏡顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有ECs特征性的Weibel-Palade小體（W-P小體，呈點狀或卵形）。
　　結(jié)論：利用組織塊法可以獲得純度較高的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，該方法簡單易用。
　　3.VEGF基因干擾質(zhì)粒對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　目的：應(yīng)用人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)干擾質(zhì)粒，

10、作用于體外培養(yǎng)的人增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其對VEGF分泌及對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　方法：利用脂質(zhì)體法將真核表達(dá)質(zhì)粒pGCsi-U6NeoRFP-shVEGF轉(zhuǎn)染到HemECs。采用倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果；用MTT法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分析觀察shVEGF對HemECs的影響。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染組的HemECs與對照組相比，VEGF表達(dá)明顯減少，轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中的VEGF表達(dá)量在轉(zhuǎn)染的第1、3、5、7

11、天分別為141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95及40.65±6.71pg/ml于其它組比較P＜0.05，且VEGF質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使VEGF的表達(dá)下降也促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)染VEGF干擾質(zhì)?？梢悦黠@減少血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)，同時也促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
　　4.VEGF干擾慢病毒對裸鼠血管瘤移植模型的影響
　　目的：制作VEGF慢病毒干擾載體Lenti-siRNA-VEGF，將其作用

12、于裸鼠血管瘤移植模型，觀察血管瘤的生長和凋亡的變化，探討新的血管瘤防治方法。
　　方法：將VEGF干擾質(zhì)粒包裝成慢病毒載體的Lenti-siRNA-VEGF。制作裸鼠血管瘤移植模型，將Lenti-siRNA-VEGF作用于移植模型，大體觀察瘤體變化，利用HE、免疫組化和TUNEL等方法觀察瘤體切片。再用Western-blot方法從蛋白質(zhì)水平探討VEGF被沉默后血管瘤的生長和消退情況。
　　結(jié)果：實驗組瘤體在注射后1周瘤體體

13、積開始變小，1個月后瘤體縮小變硬；對照組無明顯變化。HE檢測可見管腔閉塞，瘤體纖維化。CD31、CD34免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞數(shù)分別為7.68±0.83、10.25±1.29（P＜0.05）。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡較對照組明顯增多。Western-blot發(fā)現(xiàn)實驗組VEGF蛋白表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：Lenti-siRNA-VEGF作用于移植模型可以明顯降低瘤體VEGF的表達(dá)，促進(jìn)瘤體內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。該方法為血管瘤進(jìn)一步實驗