棉蚜化學(xué)感受蛋白的基因克隆、動(dòng)態(tài)時(shí)空表達(dá)及結(jié)合特征分析.pdf

1、昆蟲有著極發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)，藉此識(shí)別環(huán)境中大量的化學(xué)信息并做出相應(yīng)的生理和行為反應(yīng)，如逃避天敵，尋找食物源、配偶和產(chǎn)卵場(chǎng)所等。在昆蟲嗅覺感受器腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種可溶性蛋白:氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)和化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)。CSPs是一類新的蛋白，可能與昆蟲識(shí)別外界化學(xué)信息有關(guān)，但其確切的生理功能仍未知。本文基于棉蚜Aphis gossypii轉(zhuǎn)錄組數(shù)

2、據(jù)，克隆得到了7條編碼化學(xué)感受蛋白(AgosCSP)的cDNA序列，測(cè)定了棉蚜化學(xué)感受蛋白的時(shí)空表達(dá)譜，并利用蛋白體外表達(dá)技術(shù)及熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)探討了AgosCSPs的生理功能。結(jié)果如下。
　　1.棉蚜化學(xué)感受蛋白的基因克隆及序列分析
　　結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并利用同源性較高的cDNA序列和RACE技術(shù)，克隆了棉蚜7個(gè)CSP基因的全長(zhǎng)cDNA序列。7個(gè)基因分別命名為分別命名為AgosCSP1(GenBank登錄號(hào):KC0177

3、50)、AgosCSP2(GenBank登錄號(hào):KC017751)、AgosCSP3(GenBank登錄號(hào):KJ451424)、AosCSP(GenBank登錄號(hào):KJ451425)、AgosCSP8(GenBank登錄號(hào):KC017753)、AgosCSP13(GenBank登錄號(hào):FJ387488)、AgosCSP17(GenBank登錄號(hào):KC017754)。序列分析表明，所有CSP均具有典型CSP的序列特征，其中包括4個(gè)保守的半

4、胱氨酸位點(diǎn)。
　　2.棉蚜化學(xué)感受蛋白動(dòng)態(tài)時(shí)空表達(dá)分析
　　采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)AgosCSPs在不同時(shí)期、不同蟲態(tài)的棉蚜中mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了分析，同時(shí)選取秋蚜無(wú)翅成蟲作為材料研究了AgosCSPs在秋蚜不同組織中的分布情況。試驗(yàn)結(jié)果表明AgosCSPs表達(dá)分布較廣泛，在不同時(shí)期不同組織中都有表達(dá)，且表達(dá)是有差異的。推測(cè)其可能執(zhí)行者各種不同的生理功能。其中AgosCSP1在秋蚜無(wú)翅成蟲的表達(dá)量較高，結(jié)合其在足中表達(dá)量

5、顯著高于其他組織，推測(cè)其在寄主定位中有作用;AgosCSP2在越冬寄主木槿樹上的棉蚜中相對(duì)表達(dá)量較其他時(shí)期的棉蚜低，在取食棉花的伏蚜和秋蚜中表達(dá)量較高，推測(cè)該基因與棉蚜對(duì)寄主適應(yīng)性有關(guān)。而AgosCSP2在相同時(shí)期、寄主相同的棉蚜若蟲中相對(duì)表達(dá)量高于成蟲表達(dá)量，暗示該基因主要參與棉蚜若蟲對(duì)寄主的適應(yīng)過(guò)程;AgosCSP3在苗蚜無(wú)翅型表達(dá)量要顯著高于在其他時(shí)期，暗示該基因可能涉及對(duì)苗蚜無(wú)翅成蟲和無(wú)翅若蟲的行為影響。
　　3.棉蚜化學(xué)

6、感受蛋白的體外表達(dá)及純化
　　將PCR擴(kuò)增的AgosCSPs目的產(chǎn)物連接到帶有與特異性引物相同酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建pGEX-4T-1/AgosCSPs重組表達(dá)載體。并選擇BL21(DE3)作為表達(dá)菌株，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng)分析，表達(dá)出的蛋白全部為可溶性，經(jīng)親和層析、凝血酶處理后純化出6個(gè)高純度的棉蚜CSP蛋白。
　　4.棉蚜化學(xué)感受蛋白與配體結(jié)合能力分析
　　利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方