綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究.pdf

1、自克隆綿羊“多莉”誕生以來，體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)歷十多年的發(fā)展，但生產(chǎn)克隆綿羊的效率仍然很低，且綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的每一環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)其造成影響。為篩選并優(yōu)化一套適于綿羊體外受精與體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)的方法體系，進(jìn)一步提高綿羊體外胚胎生產(chǎn)效率，本研究以屠宰場(chǎng)采集綿羊卵巢、妊娠30d綿羊胎兒和成年敖漢細(xì)毛羊耳緣組織為實(shí)驗(yàn)材料，重點(diǎn)研究并優(yōu)化了卵母細(xì)胞采集、體外成熟、供體細(xì)胞培養(yǎng)、體細(xì)胞核移植和胚胎體外培養(yǎng)等技術(shù)環(huán)節(jié)，具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下。

2、r>　　比較了卵泡沖洗法、剖切法、注射器抽吸法和真空泵抽吸法對(duì)采集卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的影響;比較了成熟培養(yǎng)液中添加BIONICHE或?qū)幉に貜SFSH/LH、添加發(fā)情綿羊血清(ESS)或胎牛血清(FBS)對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響;比較了mSOF和mCR培養(yǎng)體系對(duì)綿羊體外受精胚胎囊胚率的影響。結(jié)果表明，卵泡沖洗法獲得A、B兩級(jí)卵母細(xì)胞比例顯著高于其余三種方法(P＜0.05);成熟液聯(lián)合添加ESS和FSH/LH(BIONICHE)，卵母細(xì)胞成熟

3、率顯著高于其他添加方式(P＜0.05);mSOF和mCR胚胎培養(yǎng)體系卵裂率無顯著差異(P＞0.05)，但mSOF組囊胚率和孵化率均顯著高于mCR組(P＜0.05)。
　　建立了綿羊胎兒與耳緣成纖維細(xì)胞系并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，探究了綿羊體細(xì)胞培養(yǎng)體系、體細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與細(xì)胞核型。研究結(jié)果表明，綿羊耳緣成纖維細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度、傳代過程細(xì)胞貼壁率和細(xì)胞形態(tài)均優(yōu)于DMEM培養(yǎng)基;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，綿羊胎兒和耳緣成纖維細(xì)胞均呈

4、現(xiàn)S型生長(zhǎng)特點(diǎn)，且胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于后者;核型分析結(jié)果表明，建立的胎兒與耳緣成纖維細(xì)胞系處于正常染色體數(shù)核型的比例較高。
　　卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后，采用微電極融合、無透明帶克隆與顯微注射等核移植方法進(jìn)行核移植，比較胚胎構(gòu)建效率，利用綿羊孤雌激活摸索胚胎培養(yǎng)液中添加維生素C最適濃度，將該濃度用于克隆胚胎體外培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育情況。結(jié)果表明，25V電壓微電極融合法的融合率顯著高于平行電極融合法(P＜0.05)，但與30

5、V電壓微電極融合法差異不顯著（P＞0.05）。采用25 V電壓微電極融合法死卵率顯著低于30 V融合法(P＜0.05);無透明帶融合法構(gòu)建克隆胚胎的桑葚胚率顯著高于顯微注射法（P＜0.05），但兩種方法獲得卵裂率和囊胚率差異均不顯著（P＞0.05）;胚胎培養(yǎng)液中添加50μM維生素C可顯著提高綿羊孤雌激活與體細(xì)胞克隆胚胎囊胚率(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果表明，應(yīng)用改進(jìn)的卵泡沖洗法采集綿羊卵母細(xì)胞可顯著提高采集質(zhì)量和數(shù)量。成熟液中