層層自組裝多功能納米基因載體的研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及人類基因組計(jì)劃的完成,基因治療為克服遺傳病、惡性腫瘤、心腦血管疾病等嚴(yán)重威脅人類健康的疾病提供了新的方式?；蛑委熓菍⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用而達(dá)到治療疾病的目的。由于裸露的外源基因易被機(jī)體或細(xì)胞中的核酸酶所降解,表達(dá)效率低,因此就需要選擇高效的基因載體攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞,降低其被降解的幾率,提高基因表達(dá)的效率。目前常用的基因載體分為病毒載體和非病毒載

2、體。與病毒基因載體相比,非病毒載體具有安全性高、低免疫原性、無基因插入片段大小限制以及易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì),但是其基因轉(zhuǎn)染的效率較低。隨著對(duì)基因傳遞過程的深入了解,人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到,安全高效的基因傳遞需要多功能化的非病毒基因載體:如應(yīng)具有長(zhǎng)循環(huán)功能、細(xì)胞或組織靶向功能、內(nèi)吞體逃逸功能以及核靶向功能等。顯然,在一種單一的載體上有效實(shí)現(xiàn)上述功能非常困難。因此,如何將各種功能化的材料組裝于同一基因載體中是目前非病毒基因載體研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一

3、。
　　 基于靜電吸引力的層層自組裝(Layer-by-Layer,LbL)技術(shù)為構(gòu)建多層次的超分子結(jié)構(gòu)提供了新的方式,其操作簡(jiǎn)便、組裝過程可控、不使用有機(jī)溶劑,有助于保持基因的生物活性。因此,本課題采用LbL技術(shù),以各種功能化的聚電解質(zhì)為材料,成功構(gòu)建了多功能納米基因載體。首先以具有核靶向功能的魚精蛋白壓縮DNA形成荷正電的內(nèi)核,然后以此為模板,依次組裝DNA層、具內(nèi)吞體逃逸功能的陽(yáng)離子LHIN脂質(zhì)層和具有長(zhǎng)循環(huán)功能的pH敏感

4、性羧甲基殼聚糖(CMCS),最終構(gòu)建了具有長(zhǎng)循環(huán)功能、細(xì)胞膜穿透功能、內(nèi)吞體逃逸功能、高DNA量和核靶向功能的多功能納米基因載體。課題的主要研究方法和結(jié)果如下:
　　 1.聚陽(yáng)離子多層納米粒的研究
　　 在LbL自組裝過程中,模板納米粒的電荷性質(zhì)、聚電解質(zhì)的用量、溶液的離子強(qiáng)度,都會(huì)對(duì)組裝體的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。本課題首先制備了聚陽(yáng)離子多層納米粒,考察了影響聚電解質(zhì)材料組裝過程的影響因素,為進(jìn)一步將聚合物電解質(zhì)材料用于多

5、功能納米基因載體的組裝提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。魚精蛋白(Pro)壓縮DNA后形成致密的Pro/DNA復(fù)合物納米粒,其表面帶有高密度的正電荷,可以作為組裝過程的模板。因此,課題首先采用具有核定位功能的Pro壓縮DNA形成二元復(fù)合物,然后以此復(fù)合物為模板,通過LbL技術(shù),依次沉積陰離子DNA層和陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)層,制備了PEUDNA/Pro/DNA聚陽(yáng)離子多層納米粒。該納米粒形態(tài)呈球形或類球形,粒徑為150.1±2.9nm,電位為14.9

6、±2.1 mV,隨著各層的組裝,電位發(fā)生了逆轉(zhuǎn),粒徑逐漸增大。PEI/DNA/Pro/DNA納米?？梢员Ｗo(hù)DNA免受核酸酶的降解,其對(duì)HepG2和HeLa細(xì)胞的毒性均較低,明顯低于商品化PEI/DNA(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染條件下,在HepG2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率明顯高于PEI/DNA(P＜0.05)。因此,采用層層自組裝技術(shù)對(duì)于構(gòu)建高效低毒的基因載體具有極大的應(yīng)用潛力。
　　 2.脂質(zhì)體包裹PEI/DNA復(fù)合物納米粒的

7、研究
　　 采用層層自組裝技術(shù)組裝非病毒基因載體的過程中,除了使用各種聚電解質(zhì)材料外,還可以使用荷電的脂質(zhì)體。相比于聚電解質(zhì)材料,脂質(zhì)體具有類似生物膜的雙分子層狀結(jié)構(gòu),有很好的細(xì)胞親和性與組織相容性,還可以通過融合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),提高載體的入胞效率。由于脂質(zhì)體的電荷及親疏水性質(zhì)遠(yuǎn)不同于聚電解質(zhì),因此有必要研究脂質(zhì)體的LbL組裝行為。本課題采用陰離子脂質(zhì)體對(duì)PEI/DNA復(fù)合物進(jìn)行包裹,制備脂質(zhì)體/PEI/DNA三元納米粒(Lipo/

8、PEI/DNAternary nanoparticles)。該三元納米粒形態(tài)呈球形或類球形,平均粒徑為234.2±6.9nm,Zeta電位為.20.7±2.5 mV,具有較強(qiáng)抗核酸酶能力和較好的血漿穩(wěn)定性,具有緩釋效果,且無突釋效應(yīng),體外釋放曲線符合Ritger-Peppas equation釋放動(dòng)力學(xué)方程:1nQ=0.76711nt+2.9238(r=0.9942)。三元納米粒的細(xì)胞毒性較低,具有一定的血清穩(wěn)定性,在轉(zhuǎn)染介質(zhì)中含有血清

9、時(shí)仍能夠高效的轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,優(yōu)于PEI/DNA復(fù)合物。因此,Lipo/PEI/DNA具有一定的血漿穩(wěn)定性,有望擴(kuò)展至體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的研究。同時(shí),認(rèn)識(shí)脂質(zhì)體在聚電解質(zhì)內(nèi)核表面的組裝行為,為荷電性的脂質(zhì)體用于層層自組裝奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.新型陽(yáng)離子LHLN脂質(zhì)體的研究
　　 層層自組裝所使用的陽(yáng)離子組裝材料中,陽(yáng)離子脂質(zhì)體是目前廣泛研究的非病毒基因載體,其易于大規(guī)模生產(chǎn),具有較低的免疫原性和較高的攜帶DNA能力,能夠通

10、過內(nèi)吞途徑有效攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞,同時(shí)大多數(shù)陽(yáng)離子脂質(zhì)體中含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE),具有內(nèi)吞體逃逸功能,非常適用于多功能納米基因載體的構(gòu)建。但是陽(yáng)離子脂質(zhì)體的毒性問題限制了其廣泛應(yīng)用。本課題以課題組自行合成的LHLN作為新型陽(yáng)離子類脂與中性磷脂DOPE合用,采用薄膜.超聲分散法制備了新型高效、低毒的陽(yáng)離子LHLN脂質(zhì)體,并對(duì)其體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染的效率進(jìn)行了考察。陽(yáng)離子LHLN脂質(zhì)體和載基因LHLN脂質(zhì)體均呈球形或類球形,其中載基因

11、LHLN脂質(zhì)體的內(nèi)部有許多空泡。LHLN脂質(zhì)體和載基因LHLN脂質(zhì)體的平均粒徑分別為120.6±2.4 nm和226.3±6.8 nm,Zeta電位分別為38.9±1.9mV和20.5±2.1 mV。LHLN脂質(zhì)體可以高效的結(jié)合DNA,保護(hù)DNA免受核酸酶的降解。轉(zhuǎn)染劑量下,LHLN脂質(zhì)體對(duì)HepG2和A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯低于商品化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(P＜0.05),而在這兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染能力與Lip

12、ofectamine2000相當(dāng)。體內(nèi)大鼠肺部基因轉(zhuǎn)染研究中,LHLN脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率明顯高于商品化Lipofectamine2000(P＜0.05)。因此,LHLN脂質(zhì)體是一種高效低毒的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,有望替代Lipofectamine2000,廣泛用于基因轉(zhuǎn)染的研究。同時(shí),其也為陽(yáng)離子脂質(zhì)體參與多功能納米基因載體的構(gòu)建提供了關(guān)鍵性的功能材料。
　　 4.羧甲基殼聚糖修飾多功能載基因納米粒的研究
　　 在對(duì)不同電解質(zhì)材料

13、的組裝性質(zhì)和陽(yáng)離子LHLN脂質(zhì)體的研究基礎(chǔ)上,旨在通過層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多功能納米基因載體。采用具有核靶向功能的魚精蛋白(Pro)壓縮DNA形成荷正電的Pro/DNA復(fù)合物,以此復(fù)合物為模板,依次組裝DNA層、具內(nèi)吞體逃逸功能的陽(yáng)離子LHLN脂質(zhì)層以及長(zhǎng)循環(huán)功能的pH敏感CMCS層。利用LbL技術(shù),首先將DNA吸附于荷正電的模板表面形成DNA/Pro/DNA(DPD),然后將陽(yáng)離子脂質(zhì)體組裝于DPD的表面就獲得了脂質(zhì)體包裹的DPD(CL

14、DPD),最后在荷正電的CLDPD的表面組裝CMCS,成功制備了多功能納米基因載體(CMCS-CLDPD)。組裝過程中,DNA/Pro/DNA、CIDPD及CMCS-CLDPD表面均可以觀察到明顯的層狀結(jié)構(gòu),電位隨著組裝過程的進(jìn)行也逐步發(fā)生了逆轉(zhuǎn),驗(yàn)證了多層結(jié)構(gòu)納米粒的形成。CMCS-CLDPD呈球形或類球形,有明顯的核殼結(jié)構(gòu),平均粒徑為210.9±6.8 nm,Zeta電位為-8.9±2.7 mV,具有較強(qiáng)的抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。

15、比較了CMCS-CLDPD在不同pH值的緩沖液中DNA的釋放行為,發(fā)現(xiàn)載體中的DNA在酸性介質(zhì)中的釋放更快。測(cè)定不同PBS中CMCS-CLDPD的電位,當(dāng)pH≤6.5時(shí),電位發(fā)生逆轉(zhuǎn),說明外層的CMCS具有pH敏感性,可以在pH≤6.5時(shí)響應(yīng)性脫落。CMCS-CLDPD的細(xì)胞毒性較低,可以高效轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,在不含血清培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)染結(jié)果存在如下關(guān)系:pH7.4條件下,CLDPD＞PEI/DNA＞CMCS-CLDPD(P＜0.05);

16、pH6.5條件下,[CMCS-CLDPD、CLDPD]＞PEI/DNA(P＜0.05),而此時(shí)CMCS-CLDPD與CLDPD轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異。結(jié)果表明,CMCS-CLDPD在pH6.5條件下可以選擇性的脫落外層CMCS,暴露陽(yáng)離子CLDPD,提高了基因轉(zhuǎn)染的效率。在含20％血清的培養(yǎng)基(pH7.4條件)中,轉(zhuǎn)染效率存在如下關(guān)系:CMCS-CLDPD＞CLDPD＞PEI/DNA(P＜0.05),結(jié)果表明,CMCS-CLDPD具有較好