復(fù)合心肌組織工程聯(lián)合大網(wǎng)膜移植術(shù)治療心肌梗死的實驗研究.pdf

1、第一部分、可降解組織工程材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的制備及評價
　　 目的：采用電紡絲技術(shù)制備新型可降解材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)三維立體支架；通過掃描電鏡觀察支架超微結(jié)構(gòu)；進(jìn)行體外力學(xué)、降解性能及細(xì)胞相容性評價；進(jìn)行皮下包埋，評價其組織相容性；初步探討其作為心肌組織工程支架應(yīng)用的可行性。
　　 方法：
　　 1、PLGA三維支架的制備及超微觀察：PLGA電紡絲使用PLGA(50/50)顆粒，以氯

2、仿/DMF(體積比2:1)的混合溶液為溶劑，配成濃度分別為8％的溶液，溶液在室溫下攪拌過夜。紡絲時將聚合物溶液倒入30ml玻璃注射器中，選用8＃針頭，紡絲電壓為+10kV，接收距離為12cm，供料速率為3ml/h，接收裝置為上覆鋁箔的銅板。將獲取的紡絲樣品真空噴金后用掃描電鏡觀察其表面形貌，加速電壓為20 kV。
　　 2、對PLGA紡絲布片進(jìn)行縫合強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度測試：將PLGA紡絲布片修剪成20mm×5mm的長方形(n=7)，

3、然后將其一端夾在拉力機(jī)的夾具中，另一端用4＃手術(shù)線與布片縫合在一起，測試其縫合強(qiáng)度；將PLGA布片修剪成工字形樣條(n=8)，兩端夾在拉力機(jī)的夾具中，測試范圍長20mm，寬2mm，厚約0.5mm，進(jìn)行斷裂強(qiáng)度測試。
　　 3、PLGA紡絲布片的體外水解降解測試：將PLGA紡絲布片裁剪成尺寸約為10mm×10mm的正方形樣片(n=3×4)，去污、蒸餾水沖洗、干燥后稱重，然后放入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入PBS緩沖液完全浸潤樣片，放入37℃

4、恒溫箱內(nèi)。在第1、2、4、6周之后將樣片取出，用去離子水沖洗樣片表面的鹽離子，然后在室溫下真空干燥至恒重，進(jìn)行重量損失計算。
　　 4、PLGA紡絲布片的細(xì)胞相容性測試：以有機(jī)錫為穩(wěn)定劑的聚氯乙烯(PVC)為陽性對照組，將收集到的PVC、PLGA膜片修剪成10×10mm大小，進(jìn)行沖洗、消毒，按照膜片表面積；浸提遞質(zhì)=3 cm2:1ml的比例進(jìn)行浸提液的制備。采用浸提液L929細(xì)胞培養(yǎng)MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性測試、采用浸提液BrdU細(xì)

5、胞增殖法觀察細(xì)胞增殖情況、采用直接接觸培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　 5、PLGA紡絲布片的體內(nèi)組織相容性測試：將PLGA紡絲布片裁剪成尺寸約為10mm×10mm的樣片(n=3×3)，建立大鼠皮下包埋模型，分別于術(shù)后1、2、4周取出材料，進(jìn)行組織切片HE染色，觀察材料變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、PLGA紡絲布片絲形貌良好，尺寸較均勻，內(nèi)部相互貫通，孔徑約100～150微米不等，孔隙豐富，分布均勻，適于營

6、養(yǎng)物質(zhì)的交換及代謝產(chǎn)物的排出，能夠滿足種植細(xì)胞生長的需求。
　　 2、經(jīng)體外力學(xué)測試PLGA電紡絲布片的縫合強(qiáng)度為(4.9±0.6)N，斷裂拉伸強(qiáng)度為(1.6±0.3)MPa，可以滿足心肌補(bǔ)片材料的力學(xué)要求。
　　 3、經(jīng)重量損失計算發(fā)現(xiàn)PLGA紡絲布片在磷酸鹽緩沖液中水解降解6周后，質(zhì)量損失為13.4％，而且從第4周開始支架的降解速度加快，此外我們還觀察到第8周時材料出現(xiàn)崩解，說明此PLGA支架具有可降解性。
　

7、　 4、細(xì)胞毒性測試PLGA材料細(xì)胞毒性穩(wěn)定在0～1級水平，對照組PVC組毒性穩(wěn)定在4級水平，表明PLGA材料毒性較小，有利于細(xì)胞生長；應(yīng)用BrdU細(xì)胞增殖法觀察發(fā)現(xiàn)L929細(xì)胞從2～5天經(jīng)歷了4天的快速DNA合成期，增殖情況良好。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示L929細(xì)胞在PLGA膜片上呈梭形或三角形伸展，貼壁良好，生長旺盛，提示該材料細(xì)胞相容性良好，符合組織工程心肌支架材料的應(yīng)用要求。
　　 5、大鼠皮下包埋術(shù)后標(biāo)本切片觀察支架材料符

8、合慢性炎癥反應(yīng)過程，大鼠細(xì)胞向材料內(nèi)部遷移、增殖，并沿紡絲纖維排列，第4周形成致密結(jié)構(gòu)，組織相容性良好。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用電紡絲技術(shù)制備的PLGA紡絲支架的微觀形貌良好，滿足心肌組織工程支架材料的幾何要求；
　　 2、PLGA紡絲支架具有良好的縫合強(qiáng)度和抗拉強(qiáng)度，滿足組織工程心肌支架材料的力學(xué)要求；
　　 3、PLGA紡絲支架具有可降解性，隨著時間的延長，其降解速度加快；
　　 4、P

9、LGA支架材料無明顯細(xì)胞毒性，細(xì)胞在浸提液中的增殖良好，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也證實該材料良好的細(xì)胞相容性；
　　 5、PLGA紡絲支架具有良好的組織相容性，體內(nèi)置入未見明顯炎癥及排異反應(yīng)，可安全得進(jìn)行體內(nèi)移植。
　　 第二部分、復(fù)合組織工程聯(lián)合大網(wǎng)膜移植術(shù)治療心肌梗死的在體實驗研究
　　 目的：缺血性心臟病具有很高的發(fā)病率和死亡率，心肌梗死后心肌細(xì)胞大量死亡，最終導(dǎo)致心力衰竭，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。內(nèi)科藥物治療、冠脈

10、介入及外科手術(shù)雖能改善癥狀，但均有不足。細(xì)胞移植是一種很有前途的針對缺血性心臟病的治療手段，目前已有大量相關(guān)實驗報道，目前的細(xì)胞治療多采用注射方式，但其移植效率仍存在不足，急需尋找新的有效的治療手段和方法。新興的組織工程醫(yī)學(xué)為我們提供了新的思路：通過體外構(gòu)建出可降解PLGA三維立體支架，在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于支架材料上構(gòu)建出復(fù)合組織工程移植物進(jìn)行心外補(bǔ)片治療，提高細(xì)胞移植效率；針對移植后的血供缺陷，我們采用帶蒂大網(wǎng)膜包裹術(shù)(OP

11、)改善局部微環(huán)境，為移植物提供血運(yùn)支持；通過建立大鼠心梗模型，評價上述治療措施對心肌梗死治療的療效，為將來心肌組織工程的臨床應(yīng)用打下堅實的實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠MSCs采用全骨髓差速貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行分離、培養(yǎng)，選取生長旺盛的第3代細(xì)胞進(jìn)行體外DAPI標(biāo)記，種植于PLGA支架上體外培養(yǎng)4天。選擇4周齡雌性SD大鼠，結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作大鼠心肌梗死(Myocardial infarct

12、ion，MI)模型。心梗后1周，經(jīng)胸心臟超聲篩選左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)小于60％同時左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)小于30％的心梗鼠進(jìn)行隨機(jī)分為4組，分別為MI對照組(n=10)、MSCs-PLGA組(n=12)、PLGA-OP組(n=12)及MSCs-PLGA-OP組(n=35)，進(jìn)行二次開胸手術(shù)操作。MI對照組僅行二次開胸對照；MSCs-PLGA組單純行工程材料心梗區(qū)心外膜補(bǔ)片移植；PLGA-OP組行無細(xì)胞種植的PLGA補(bǔ)片心外膜移植復(fù)

13、合帶蒂大網(wǎng)膜包裹術(shù)；MSCs-PLGA-OP組行工程材料移植復(fù)合帶蒂大網(wǎng)膜包裹術(shù)。術(shù)后4周，應(yīng)用超聲心動圖評價左心功能，標(biāo)本取材做病理學(xué)檢測(HE染色、免疫組化染色及免疫熒光染色)。另外，MSCs-PLGA-OP組分別于術(shù)后1、2周各處死9只觀察MSCs隨時間變化的存活情況。
　　 結(jié)果：術(shù)后各組大鼠存活狀態(tài)良好，未見明顯副作用發(fā)生。超聲心動圖檢測顯示，與MI對照組(49.85％±5.03％&22.06％±2.78％)相比，MS

14、Cs-PLGA-OP組(59.68％±5.78％&27.65％±3.81％)及MSCs-PLGA組(56.89％±7.57％&26.22±4.55％)的EF和FS均有改善(p<0.05，ANOVA檢測)，而PLGA-OP組(55.46％±3.75％&25.28％±2.22％)心功能雖有改善趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；各組間的LVEDD和LVESD無統(tǒng)計學(xué)差異，說明PLGA紡絲支架富有彈性，未明顯影響心臟的舒縮功能。MSCs-PLGA-OP組術(shù)