豬瘟病毒感染細(xì)胞的代謝組學(xué)及葡萄糖促進(jìn)豬瘟病毒增殖的研究.pdf

1、豬瘟病毒（CSFV）是黃病毒科瘟病毒屬的一員，為具有囊膜的單股不分節(jié)段正鏈 RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約12.3 Kb，其含有一個(gè)能編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的開放閱讀框（ORF）。CSFV引起的豬瘟是豬的一種以廣泛出血、高熱和免疫抑制為主要特征的烈性傳染病。豬瘟爆發(fā)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須申報(bào)的動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類傳染病。目前幾乎無(wú)治療豬瘟的方法，因此有必要闡釋豬瘟病毒感染時(shí)宿主和病毒的互作機(jī)制

2、，以便開發(fā)出疫苗或者靶向藥物以有效控制感染。感染病毒的細(xì)胞代謝會(huì)發(fā)生改變，這些改變不僅能為病毒粒子增殖提供特定的物質(zhì)合成前體，同時(shí)也可增加宿主細(xì)胞的生存能力。不同病毒對(duì)被感染細(xì)胞代謝的改變有既有共性，也有差異之處。許多病毒感染會(huì)引起宿主有氧糖酵解即瓦爾堡效應(yīng)，有些病毒感染能促進(jìn)宿主脂肪酸合成和谷氨酰胺代謝。因此有必要明確病毒怎么改變細(xì)胞代謝以及這些改變發(fā)生在病毒生活史的哪個(gè)階段，這將有助于人們更好的理解病毒復(fù)制與感染所需要的條件，為抑制

3、病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖提供潛在靶點(diǎn)，從而為抗病毒研究提供新思路。
　　本研究采用基于超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）和氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的代謝組學(xué)方法對(duì)豬睪丸細(xì)胞（ST）感染豬瘟病毒后12 h、24 h和48 h實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，建立包括主成分分析、偏最小二乘判別分析和正交偏最小二乘判別分析在內(nèi)的多維統(tǒng)計(jì)分析模型，并結(jié)合單維統(tǒng)計(jì)分析篩選出差異代謝物。之后將UPL

4、C-Q-TOF/MS在正負(fù)離子兩種模式下篩選到的差異代謝物和progenesis QI軟件自帶數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)定性，GC-MS篩選到的差異代謝物通過(guò)和NIST數(shù)據(jù)庫(kù)及Feihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)判定，綜合UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知CSFV感染ST細(xì)胞后導(dǎo)致214種代謝物發(fā)生改變，其中脂類有102個(gè)（磷脂占75個(gè)）、氨基酸有36個(gè)、碳水化合物有33個(gè)、核苷酸有24個(gè)，其他如輔酶及激素類物質(zhì)共計(jì)19個(gè)。將差異代謝物進(jìn)行pa

5、thway分析，發(fā)現(xiàn)ST細(xì)胞感染豬瘟病毒后發(fā)生紊亂的代謝通路包括磷脂代謝、氨基酸合成、氨酰-tRNA合成、嘧啶代謝、碳代謝及泛酸與輔酶A代謝，氨基酸中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝，代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了豬瘟病毒感染ST細(xì)胞后引起宿主細(xì)胞代謝的強(qiáng)烈變化。
　　代謝組學(xué)結(jié)果顯示感染豬瘟病毒后，細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝通路中的多個(gè)代謝物有明顯變化，然而并不清楚這些改變對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的意義。基于此，本課題研究了葡萄

6、糖和谷氨酰胺代謝對(duì)豬瘟病毒增殖的影響，首先用特定培養(yǎng)基培養(yǎng)感染CSFV的ST細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中缺乏葡萄糖時(shí)，豬瘟病毒滴度顯著低于正常培養(yǎng)基組和缺乏谷氨酰胺組。向葡萄糖剝奪培養(yǎng)基中回補(bǔ)一定的葡萄糖，24 h后收集樣品測(cè)定病毒滴度。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在0-1.0 g/L時(shí)，病毒滴度隨著葡萄糖濃度增加而顯著升高，當(dāng)葡萄糖濃度大于1.0 g/L后，病毒滴度不再隨濃度升高而變化，表明1.0 g/L葡萄糖即可實(shí)現(xiàn)病毒的最佳增殖。在正常

7、培養(yǎng)基中分別加入0 mM、25 mM和50 mM的葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖（2-DG），結(jié)果顯示2-DG處理病毒感染細(xì)胞能顯著抑制豬瘟病毒增殖，且濃度越高抑制效果越明顯。Western blot在蛋白水平驗(yàn)證了葡萄糖對(duì)CSFV Npro蛋白表達(dá)影響，抗體是針對(duì)SM株Npro抗原表位設(shè)計(jì)，能與SM株的很好反應(yīng)，但不能與GD53株反應(yīng)，從感染SM組的結(jié)果來(lái)看，缺少葡萄糖時(shí)，Npro表達(dá)量顯著下降。結(jié)合培養(yǎng)基剝奪葡萄糖實(shí)驗(yàn)和葡萄糖回補(bǔ)及抑制

8、實(shí)驗(yàn)，可以證明豬瘟病毒正常復(fù)制增殖離不開葡萄糖。本研究也初步研究了葡萄糖影響CSFV增殖的具體環(huán)節(jié)，分別測(cè)定胞內(nèi)和胞外樣品的病毒滴度和基因組拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖剝奪組胞內(nèi)胞外的CSFV基因組拷貝數(shù)及感染性病毒粒子均顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明葡萄糖是豬瘟病毒復(fù)制成熟必不可缺的物質(zhì)。缺少葡萄糖組的胞內(nèi)胞外滴度幾乎無(wú)差別，而其基因組拷貝數(shù)相差10倍以上，可以排除葡萄糖在豬瘟病毒釋放時(shí)發(fā)揮作用。為進(jìn)一步研究何種葡萄糖利用方式影響豬瘟病毒增殖，在正常培養(yǎng)

9、基中加入草氨酸鹽抑制丙酮酸向乳酸代謝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制乳酸產(chǎn)生并不影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生，表明無(wú)氧糖酵解之外的糖代謝通路影響了豬瘟病毒的增殖。最后檢測(cè)了感染豬瘟病毒后對(duì)糖代謝的影響，結(jié)果表明感染豬瘟病毒組的細(xì)胞相較對(duì)照組攝入更多葡萄糖。
　　本研究用色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)手段篩選了豬瘟病毒感染ST細(xì)胞后引起的代謝改變，首次獲得我國(guó)豬瘟病毒流行毒株感染細(xì)胞的代謝全譜。并結(jié)合豬瘟病毒增殖動(dòng)力學(xué)比較不同時(shí)間點(diǎn)接種病毒組與對(duì)照組差異代謝

10、物，發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染細(xì)胞引起糖類、脂類、氨基酸和核苷酸等多種代謝物顯著變化，并且不同時(shí)間點(diǎn)差異代謝物的種類以及升降變化側(cè)重不同，這與豬瘟病毒生活史相對(duì)應(yīng)。代謝組學(xué)結(jié)果為豬瘟病毒研究提供了切入點(diǎn)，針對(duì)這些代謝紊亂分析研究，將有助于揭示豬瘟病毒復(fù)制和致病的分子機(jī)制，并為豬瘟病毒的科學(xué)診斷防控提供參考。此外我們也進(jìn)一步探究了個(gè)別重要代謝通路改變對(duì)豬瘟病毒增殖影響，實(shí)驗(yàn)證明谷氨酰胺的有無(wú)對(duì)豬瘟病毒增殖影響不大，而葡萄糖的存在及正常代謝對(duì)豬瘟病毒