胰腺實(shí)性假乳頭狀腫瘤的組織發(fā)生及Notch信號(hào)通路的表達(dá)研究.pdf

1、胰腺實(shí)性假乳頭狀腫瘤(solid-pseudopapillary neoplasm,SPN)是一種少見(jiàn)的具有低度惡性潛能的實(shí)體性腫瘤,好發(fā)于年輕女性,約占胰腺腫瘤的1～2％。過(guò)去因?qū)ζ湔J(rèn)識(shí)不足,易誤診為無(wú)功能胰島細(xì)胞瘤,胰腺囊腺瘤,乳頭狀腺泡細(xì)胞癌等,但其預(yù)后較胰腺導(dǎo)管腺癌及胰腺內(nèi)分泌腫瘤要好。
　　 近年來(lái)因?qū)σ认賹?shí)性假乳頭狀腫瘤的病理形態(tài)學(xué)認(rèn)識(shí)的提高以及新的免疫組化標(biāo)記的廣泛應(yīng)用,國(guó)內(nèi)外對(duì)SPN的文獻(xiàn)報(bào)道病例明顯增多,但對(duì)其

2、組織起源及發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)尚不清楚,對(duì)其組織起源存在多種假設(shè),有認(rèn)為SPN可能起源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,有的認(rèn)為SPN可能起源于胰腺腺泡細(xì)胞,有的認(rèn)為來(lái)自胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞或胚胎神經(jīng)嵴,也有人認(rèn)為可能起源于胰腺多潛能干細(xì)胞,但目前尚無(wú)一致的結(jié)論,對(duì)胰腺SPN的組織發(fā)生的探討是SPN研究的一大熱點(diǎn)。
　　 2001年Taraka等報(bào)道胰腺實(shí)性假乳頭狀腫瘤幾乎所有病例均存在Wnt—β-catenin信號(hào)通路的活化,即編碼β-catenin的

3、CTNNB1基因的3號(hào)外顯子出現(xiàn)點(diǎn)突變,導(dǎo)致β-catenin蛋白難以在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)磷酸化及降解并與Tcf／Lef形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),激活MYC及Cyclin D1等癌基因的轉(zhuǎn)錄,即Wnt-β-catenin信號(hào)通路的活化。免疫組化染色β-catenin蛋白由正常胰腺導(dǎo)管及腺泡細(xì)胞胞膜陽(yáng)性轉(zhuǎn)而在SPN腫瘤細(xì)胞呈胞漿及胞核陽(yáng)性,這一染色特點(diǎn)對(duì)病理學(xué)診斷SPN有重要意義。但除Wnt-β-catenin信號(hào)通路以外,有無(wú)存在其它信號(hào)傳導(dǎo)

4、通路的改變,有無(wú)其它癌基因或抑癌基因在SPN的發(fā)生發(fā)展中起作用,近年來(lái)有關(guān)這方面的研究國(guó)內(nèi)外極少有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 DNA拷貝數(shù)的變化在人類遺傳性疾病及腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,基于微陣列技術(shù)的比較基因組雜交(aCGH)通過(guò)在一張芯片上用標(biāo)記不同熒光元素的樣品(腫瘤樣品和對(duì)照樣品)同時(shí)進(jìn)行雜交,可檢測(cè)樣本基因組和對(duì)照基因組之間DNA拷貝數(shù)的變化,直觀地表現(xiàn)出腫瘤及遺傳性疾病基因組DNA在整個(gè)染色體組的缺失或擴(kuò)增,對(duì)腫瘤而言缺

5、失部位可能包含抑癌基因,而擴(kuò)增片段則可能存在癌基因。這對(duì)于尋找與腫瘤發(fā)生相關(guān)的癌基因及抑癌基因非常有幫助,通過(guò)對(duì)SPN標(biāo)本進(jìn)行aCGH檢測(cè),捕獲與SPN發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行深入的研究,對(duì)于了解SPN的發(fā)生及發(fā)展有重要意義。
　　 2003年1月至2010年6月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診并經(jīng)穿刺及手術(shù)切除病理論斷為SPN者共48例,為探討SPN的組織起源我們選擇病史資料完整,有隨訪結(jié)果及有足夠腫瘤組織的SPN病例共20例進(jìn)行形

6、態(tài)學(xué),免疫組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察,并選擇同期因胰腺導(dǎo)管腺癌及胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤行手術(shù)切除的標(biāo)本各15例作免疫組化對(duì)照,選擇目前診斷SPN特異的免疫組化標(biāo)記物β-catenin、E-cadherin,胰腺導(dǎo)管上皮標(biāo)記物CKpan,胰腺腺泡細(xì)胞標(biāo)記物α-1-AT,胚胎神經(jīng)嵴的標(biāo)記物S-100蛋白,Melan A,神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物CgA,Syn,CD56及Secretagogin蛋白等抗體,進(jìn)行免疫組化檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),本組SPN91％為女

7、性,平均年齡為33.4歲,腫瘤大小1.2—14CM,切面易見(jiàn)出血及囊性變,組織學(xué)上由粘附性差的單一的上皮樣細(xì)胞形成實(shí)性及假乳頭狀結(jié)構(gòu),超微結(jié)構(gòu)腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)有豐富的細(xì)胞器,主要為腫脹的線粒體及酶原樣顆粒,未見(jiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。免疫組化所有SPN腫瘤細(xì)胞β-catenin胞漿及胞核陽(yáng)性,β-catenin胞膜陰性,E-cadherin免疫組化染色顯示胞膜染色完全喪失。80％SPN腫瘤細(xì)胞表達(dá)CKpan,但其染色強(qiáng)度與正常胰腺上皮細(xì)胞相比要弱

8、一些,著色細(xì)胞數(shù)量與正常胰腺上皮細(xì)胞相比也要少。95％SPN腫瘤細(xì)胞表達(dá)α-1-AT,但呈小簇狀及單個(gè)細(xì)胞陽(yáng)性。100％腫瘤細(xì)胞CD56胞膜陽(yáng)性,55％腫瘤細(xì)胞Syn胞漿陽(yáng)性,但特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物CgA只有5％腫瘤細(xì)胞胞漿陽(yáng)性,Secretagogin腫瘤細(xì)胞均陰性,S-100有1例(5％),Melan A有2例(10％)腫瘤細(xì)胞胞漿陽(yáng)性,我們的形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察結(jié)果支持SPN起源于胰腺多潛能干細(xì)胞,并向胰腺外分泌,內(nèi)分泌及神經(jīng)

9、外胚葉多向分化,其不同的免疫組化標(biāo)記表達(dá)可能是多潛能干細(xì)胞沿不同方向或不同階段分化的結(jié)果。
　　 為了解在SPN發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中除Wnt-β—catenin信號(hào)通路活化外,有無(wú)其它癌基因,抑癌基因及其相關(guān)信號(hào)通路的改變,我們?cè)跈z測(cè)β-catenin基因3號(hào)外顯子突變的基礎(chǔ)上,對(duì)10例SPN樣本進(jìn)行了高通量的aCGH檢測(cè),若將待測(cè)DNA與對(duì)照DNA熒光強(qiáng)度之比的log2 ratio≥0.2或≤-0.2,即相當(dāng)于每個(gè)位點(diǎn)≥3個(gè)DNA

10、拷貝數(shù)改變,分別作為DNA有擴(kuò)增或缺失的閥值,結(jié)果在10例SPN樣本中共檢測(cè)到有DNA拷貝數(shù)改變的染色體區(qū)域112個(gè),最多的一例有53個(gè),最少的12個(gè),平均每例22.3個(gè),每一樣本檢測(cè)到擴(kuò)增的區(qū)域要明顯多于缺失的區(qū)域,平均每例檢測(cè)到擴(kuò)增區(qū)域19.5個(gè),缺失區(qū)域3.4個(gè),最常見(jiàn)的擴(kuò)增區(qū)包括1p,2q,4q,5q,8p,9p,10q,11q,13q,15p,15q,16p,19q,20p,21q,22q,Xp,而缺失的區(qū)域主要位于11q,1

11、7p,20p及Y染色體上。若將Log2 ratio定于≥0.75或≤-0.75,即相當(dāng)于閥值3.5倍的DNA拷貝數(shù)改變作為高水平擴(kuò)增或缺失閥值,則共有58個(gè)區(qū)域檢測(cè)到高水平擴(kuò)增,主要是1p,2q,4q,5q,9p,10q,11q,13q,15p,15q,19q,20p,21q,22q,而缺失則位于11q及Y染色體上。對(duì)于存在高水平擴(kuò)增的DNA區(qū)域,通過(guò)查找胰腺表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù),篩查相關(guān)的候選基因,我們發(fā)現(xiàn)除Wnt-β-catenin信號(hào)通路相

12、關(guān)的幾個(gè)基因位點(diǎn)出現(xiàn)擴(kuò)增外,還發(fā)現(xiàn)Notch2所在染色體1p12區(qū)域易檢測(cè)到高水平的擴(kuò)增,其次為OR4F4等所在的15q26.3及OR4M1等所在的14q11區(qū)域易檢測(cè)到高水平擴(kuò)增。而在胰腺導(dǎo)管腺癌中易出現(xiàn)的KRAS,P53,P16及DPC4基因及CDKN2A,SMAD4,DCC等抑癌基因未能在SPN中檢測(cè)到,提示在SPN的發(fā)生及發(fā)展中出現(xiàn)的分子遺傳學(xué)改變與胰腺導(dǎo)管腺癌不同。
　　 SPN是一種具有低度惡性潛能的胰腺實(shí)體性腫瘤,

13、目前尚無(wú)判斷其預(yù)后的形態(tài)學(xué)金標(biāo)準(zhǔn),我們對(duì)作aCGH檢測(cè)的10例SPN標(biāo)本,以①腫瘤>5CM；②出現(xiàn)腫瘤性壞死；③侵犯胰腺周圍軟組織；④脈管／神經(jīng)周圍侵犯；⑤核分裂像增多或增殖指數(shù)增高作為具有侵襲性特征的組織學(xué)指標(biāo),我們發(fā)現(xiàn)具有較多侵襲性特征組織學(xué)指標(biāo)的SPN樣本易檢測(cè)到DNA拷貝數(shù)改變,且出現(xiàn)高水平擴(kuò)增者要多于無(wú)侵襲性組織學(xué)特征的SPN樣本。
　　 在aCGH初步篩選的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步探討Notch信號(hào)通路在SPN發(fā)生發(fā)展中的作

14、用,我們選擇冷凍新鮮的SPN,PDAC,PET及正常胰腺組織樣本各10例,用RT-PCR法檢測(cè)了Notch信號(hào)通路的主要成分Notchl,Notch2,Notch4及Jagged-1mRNA在這些樣本中的表達(dá),并選擇SPN,PDAC,PET及正常胰腺組織各20例常規(guī)石蠟存檔標(biāo)本,用免疫組化法檢測(cè)了Notchl,Notch3,Jagged-1及CyclinD1蛋白在這些樣本中的表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)Notch2 mRNA在SPN中表達(dá)明顯上調(diào)

15、,Notch1,Jagged-1 mRNA在SPN中表達(dá)亦上調(diào),Notch4 mRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。Notch1,Jagged-1及CyclinD1蛋白在SPN中表達(dá)明顯上調(diào),而Notch3未見(jiàn)明顯改變,提示Notch信號(hào)通路與SPN的發(fā)生有密切的關(guān)系,活化的Notch信號(hào)通路有助于維持SPN部分腫瘤細(xì)胞處于未分化的多潛能干細(xì)胞狀態(tài)。Notch信號(hào)通路可能通過(guò)CyclinD1與Wnt-β-catenin信號(hào)通路協(xié)同作用,參與SPN

16、的發(fā)生發(fā)展。免疫組化法檢測(cè)Notch1及Jagged-1在SPN中呈強(qiáng)陽(yáng)性,而在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中呈弱陽(yáng)性或不表達(dá),有助于我們運(yùn)用此方法在日常病理論斷中將胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤與胰腺實(shí)性假乳頭狀腫瘤鑒別開(kāi)來(lái)。
　　 根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以得出以下結(jié)論:
　　 1.胰腺SPN可能起源于胰腺多潛能干細(xì)胞,并向胰腺外分泌,內(nèi)分泌及神經(jīng)嵴多向分化,其不同的免疫組化標(biāo)記表達(dá)可能是多潛能干細(xì)胞沿不同方向或不同階段分化的結(jié)果。

17、　　 2.aCGH檢測(cè)結(jié)果提示SPN除存在Wnt—β-catenin信號(hào)通路異常活化外,可能與Notch信號(hào)通路的活化有關(guān),其發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)的分子遺傳學(xué)改變與胰腺導(dǎo)管腺癌不同,組織學(xué)上具有較多的侵襲性特征者,aCGH易檢測(cè)出高水平擴(kuò)增。
　　 3.Notch信號(hào)通路中的主要成分Notch1,Notch2及Jagged-1在SPN中呈高表達(dá),Notch3,Notch4弱表達(dá)或不表達(dá),提示Notch信號(hào)通路與SPN的發(fā)生發(fā)展有密切