促炎癥細(xì)胞因子HMGB1在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病表達(dá)變化和臨床意義.pdf

1、研究背景及意義:
　　 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道疾病,以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征。慢性阻塞肺疾病(COPD)也是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題,COPD的死亡率目前居全球死因第四位。慢性炎癥在支氣管哮喘和COPD的發(fā)病過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。而細(xì)胞因子在促進(jìn)哮喘和COPD的慢性炎癥和呼吸道結(jié)構(gòu)變化過(guò)程起重要作用,研究發(fā)現(xiàn)在哮喘和COPD的誘導(dǎo)痰和支氣管肺泡灌洗液中促炎癥

2、細(xì)胞因子如TNF-a,IL-1β和IL-6等顯著升高,這些因子進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。目前認(rèn)為:慢性氣道炎癥是哮喘和COPD的共同特征,但兩者炎癥特點(diǎn)存在明顯不同。
　　 高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有顯著促炎效應(yīng)的細(xì)胞因子。
　　 HNGB1是在細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在的DNA的結(jié)合蛋白,參與維持核酸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等。近年來(lái)在動(dòng)物模型和人類疾病的研究上發(fā)現(xiàn)HMGB1釋放到胞外后發(fā)揮促炎癥細(xì)胞因子的功能。

3、HMGB1可以從激活的免疫細(xì)胞如:單核巨噬細(xì)胞中釋放出來(lái),也能夠從損傷和壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放出來(lái),激發(fā)“壞死誘導(dǎo)炎癥”。HMGB1可以誘導(dǎo)許多炎癥因子如TNF-α,IL-1,IL-6和IL-8等的釋放,也能激活人內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致其粘附分子的表達(dá)上調(diào)。在細(xì)胞系和動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn),HMGB1主要與TLR 2,TLR 4 和RAGE三種受體相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB通路活化,參與免疫、炎癥調(diào)節(jié)。在膿毒血癥、內(nèi)毒素血癥、關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn),應(yīng)

4、用HMGB1抗體可以起到保護(hù)作用。在膿毒血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥狀態(tài)下,HMGB1在血漿中顯著升高。
　　 許多的細(xì)胞因了如TNF-α,IL-1β在哮喘、COPD中表達(dá)升高,同時(shí)這些因子可以誘導(dǎo)HMGB1從免疫細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞釋放出來(lái)。因此推測(cè)HMGBl可能參與了哮喘和COPD的發(fā)病,但目前關(guān)于HMGB1在哮喘和COPD中的表達(dá)和作用研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討HMGB1在哮喘和COPD誘導(dǎo)痰和血漿中的表達(dá)變化及差異,探討H

5、MGB1表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度及炎癥表型的關(guān)系,進(jìn)一步在OVA致敏的哮喘模型研究HMGB1在支氣管肺泡灌洗液和肺組織的表達(dá)情況,以初步明確HMGB1在哮喘及COPD的表達(dá)情況和臨床意義。
　　 方法:
　　 一、臨床實(shí)驗(yàn)
　　 1、確定哮喘和COPD患者入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2、收集患者基木資料和行肺功能檢查。
　　 3、收集和處理患者誘導(dǎo)痰和外周血標(biāo)本
　　 4、ELISA法檢測(cè)患

6、者的血漿和誘導(dǎo)痰中HMCB1的表達(dá)水平。
　　 二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 哮喘小鼠模型肺組織和支氣管肺泡灌洗液HMGB1的表達(dá)變化
　　 18只雌性BALB/c小鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)化的分組分為3組:對(duì)照組,OVA組(哮喘組),OVA/DM組(地塞米松組)。
　　 無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性:不同濃度乙酰甲膽堿(Sigma；0,3.125,6.25,12.5,25 and 50 mg/ml溶解在等滲生理鹽

7、水)激發(fā),BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)Penh值。
　　 小鼠氣管灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù):PBS灌洗,灌洗液上清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因了HMGB1；灌洗液離心沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù),蘇木素-伊紅(HE)染色細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。ELISA檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-Y、HMGB1含量。
　　 小鼠肺臟組織病理觀察:取出小鼠肺組織、固定,然后脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺臟病理變化。
　　 小

8、鼠肺臟組織HMGBl蛋白western blotting檢測(cè),Quantity One軟件分析HMGBl的相對(duì)表達(dá)量。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法SHSNK法檢驗(yàn),方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Dunnett's T3法

9、檢驗(yàn)。樣本率和構(gòu)成比比較用X 2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析.以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、哮喘和COPD患者血漿和誘導(dǎo)痰中的HMGB1含量均顯著增高,提示HMGBl可能參與了哮喘和COPD的發(fā)病過(guò)程。
　　 2、在急件加重期的COPD患者,HMGB1的含量顯著增高,提示HMGB1在COPD的急性加重期有一定作用。同時(shí)血漿和誘導(dǎo)痰中HMGB1的含量與肺功能指標(biāo)顯著負(fù)相關(guān),提