組胺受體2的激活通過擾亂心肌線粒體和內(nèi)皮功能而加重心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、背景與目的:
　　 組胺是人體組織內(nèi)的一種廣泛參與免疫反應(yīng)和誘發(fā)炎癥反應(yīng)的有機(jī)氮化合物，它主要由嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生。研究表明，在應(yīng)激條件下，心肌肥大細(xì)胞的激活和組織胺的釋放廣泛參與了一系列的心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，例如:心肌缺血再灌注損傷、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、慢性心衰，等等。組胺受體1和受體2在心肌和血管內(nèi)皮中均有表達(dá)，它們同屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在一系列的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨

2、床試驗(yàn)均表明，組胺受體2的阻斷能改善心肌缺血再灌注損傷和緩解心衰并提高患者的生存率。但是，這種保護(hù)作用的機(jī)制目前并不十分清楚。組織胺受體2的激活在冠心病當(dāng)中的機(jī)制普遍認(rèn)為是與β1腎上腺素受體介導(dǎo)的cAMP-PKA信號(hào)機(jī)制相同，除此之外并無深入的探討和研究。目前的研究已經(jīng)證實(shí)組胺受體2的拮抗劑對(duì)于神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用。同時(shí)，還有大量的研究表明心肌線粒體功能和血管內(nèi)皮功能的紊亂在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程中起到至關(guān)重要的作用。但是

3、，組織胺受體2的激活對(duì)心肌線粒體功能和內(nèi)皮功能影響的研究并無報(bào)道。因此，本研究假設(shè)組胺受體2的激活能通過增加心肌線粒體通透性和血管內(nèi)皮通透性而加重心肌的缺血再灌注損傷。本研究的目的在于探討組織胺受體2的過度激活對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響以及探討其具體的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.病人血清的組胺濃度測定收集急性心梗病人(AMI≤6d)、不穩(wěn)定性心絞痛病人和健康人全血，用ELISA方法測定血清組胺濃度。
　

4、　 2.細(xì)胞分離培養(yǎng)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)原代SD乳鼠心肌細(xì)胞和傳代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)用MTT和Hoechst方法檢測不同濃度組胺(0.01-100μM)對(duì)心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響。
　　 3.心肌缺血和缺血再灌注損傷模型的建立和處理11-12周齡C57BL/6雄性小鼠和組胺受體2基因敲除小鼠，體重約25-30 g，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟。以8-0尼龍線穿過左心耳下

5、緣1-2 mm處的2/3心肌層，短暫結(jié)扎或永久結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈，誘導(dǎo)心肌缺血45 min后解除結(jié)扎使其再灌注24 h或永久梗死24 h。實(shí)驗(yàn)各分為6組，每組5只，組別為:WT-sham，WT-control，WT-AD，KO-control，WT-fam，WT-fam+AD，組胺受體2特異性阻斷劑fam(famotidine)和特異性激動(dòng)劑AD（amthamine dihydrobromide）分別于術(shù)前30 min腹腔注射給藥，術(shù)后2

6、4 h處死存活的小鼠，提取心臟，分別進(jìn)行western blot、免疫組化和TTC染色。用于蛋白分析的小鼠心臟保存于-80℃;用于免疫組化的小鼠心臟橫切后置于4％多聚甲醛中固定24 h再進(jìn)行脫水和石蠟包埋;用于TTC染色的小鼠心臟先凍于-20度15 min，取出后均勻切成5片用TTC染色進(jìn)行心梗面積分析。
　　 4.基因和蛋白表達(dá)分析提取原代培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞和傳代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA后再逆轉(zhuǎn)錄成eDNA，對(duì)鼠或人

7、的ANP(atrial natriuretic peptide)、β-MHC(beta-myosin heavy chain)、TNF-α(tunour necrosis factor alpha)、4個(gè)組胺受體、β-actin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　 提取原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠心肌組織總蛋白或分離原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和

8、小鼠心肌組織線粒體蛋白，應(yīng)用抗體檢測bax，COX-Ⅳ,ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2), p-ERK1/2,DAPK-2(death-associated protein kinase2), p-DAPK-2, caspase3,moesin, p-moesin和β-actin的蛋白表達(dá)水平并應(yīng)用Image J進(jìn)行半定量分析。
　　 將小鼠心臟組織石蠟包埋后切片為

9、5μM厚度，應(yīng)用抗體檢測心肌組織中MPO(myeloperoxidase)和caspase3的表達(dá)水平。
　　 5.心肌細(xì)胞線粒體通透性和線粒體去極化檢測乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)48 h后加入1μM濃度的組胺或AD刺激24小時(shí)，PBS沖洗3遍后加入1.0 mM的鈣黃綠素和1.0 mM的氯化鈷置于37度染色20 min，然后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察線粒體中綠色熒光的強(qiáng)弱來反映線粒體膜通透性。為了檢測線粒體去極化，加入組胺受體2特異性激動(dòng)劑A

10、D刺激24小時(shí)后，首先應(yīng)用鈣黃綠素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后應(yīng)用25 nM的MitoTracker對(duì)線粒體染色10 min，最后熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位的變化。此外，單獨(dú)加入25 nM的MitoTracker對(duì)心肌細(xì)胞染色后收集細(xì)胞，PBS沖洗5次后在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀下記錄心肌細(xì)胞當(dāng)中線粒體膜電位的變化情況。
　　 6.心肌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p-ERK1/2定位分析加入1μM濃度的組胺刺激乳鼠心肌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，抗

11、體孵育過夜結(jié)合細(xì)胞中的p-ERK1/2，同時(shí)應(yīng)用DAPI標(biāo)記心肌細(xì)胞的細(xì)胞核或應(yīng)用羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的F-actin，再應(yīng)用熒光顯微鏡對(duì)p-ERK進(jìn)行細(xì)胞定位檢測。
　　 7.臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性測量將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞傳代接種于Transwell細(xì)胞培養(yǎng)皿的上層小室中培養(yǎng)48小時(shí)后，加入1μM濃度的組胺刺激，在3h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用電阻測量儀對(duì)單層臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的電阻進(jìn)行測量和記錄。
　　 結(jié)果:
　　 1.

12、急性心梗病人血清組胺濃度增加ELISA檢測結(jié)果顯示急性心梗病人血清組胺濃度高達(dá)32.9 ng/ml，較不穩(wěn)定性心絞痛和正常人水平明顯升高2倍左右（P＜0.05），而不穩(wěn)定性心絞痛患者與正常人之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，多元回歸分析結(jié)果顯示血清組胺濃度與急性心梗具有相關(guān)性(P＜0.001)，而與年齡、性別和藥物治療無相關(guān)性。這表明血清中組胺的濃度與急性心梗密切相關(guān)。
　　 2.組胺引起心肌細(xì)胞的損傷和凋亡1μM組胺刺激24 h后，心肌

13、細(xì)胞內(nèi)ANP，β-MHC的mRNA水平明顯增加。組胺刺激24 h后，ANP的蛋白水平亦明顯增高，組胺受體2阻斷劑法莫替丁預(yù)處理能阻斷這一現(xiàn)象。MTT和Hoechest分析結(jié)果顯示組織胺在0.01μM時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞生存和凋亡無明顯影響，但是在0.1-100μM的濃度時(shí)能顯著減少心肌細(xì)胞的生存率和增加心肌細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)，提示高濃度的組胺刺激可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 3.組胺受體2的激活增加TNF-α的生成和ERK1/2

14、的磷酸化1μM的AD刺激心肌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯增加，組胺受體2阻斷劑法莫替丁能抑制這一現(xiàn)象(P＜0.05)。此外，在10 ng/mL的TNF-α刺激心肌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)ERK1/2的磷酸化水平明顯增加(P＜0.05)。
　　 4.組胺受體2的激活引起心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路與bax、p-ERK1/2、p-DAPK2和caspase3有關(guān)1μM組胺刺激心肌細(xì)胞24 h后

15、，心肌細(xì)胞胞漿的bax水平明顯增加，法莫替丁預(yù)處理能阻斷這一效應(yīng)。1μM組胺和AD都能增加bax的線粒體轉(zhuǎn)位，法莫替丁能抑制bax的線粒體轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。由于ERK1/2能調(diào)控細(xì)胞增值和細(xì)胞凋亡，ERK1/2入核啟動(dòng)了細(xì)胞的增值，而胞漿中ERK1/2的聚集可使促凋亡蛋白DAPK2磷酸化水平增高，從而啟動(dòng)線粒體途徑之外的細(xì)胞凋亡。因此我們對(duì)ERK1/2和DAPK2的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示組胺受體2的激活上調(diào)胞漿中ERK1/2和DAPK2

16、的磷酸化水平，并增加caspase3的表達(dá)，這種信號(hào)變化被法莫替丁或ERK1/2抑制劑U0126阻斷。
　　 5.ERK1/2在胞漿的聚集增加心肌細(xì)胞線粒體膜的通透性和去極化1μM組胺刺激心肌細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示心肌細(xì)胞胞漿當(dāng)中的p-ERK1/2明顯增加，同時(shí)并未發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2的核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的結(jié)果顯示，組胺和AD刺激24 h后的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣黃綠素的綠色熒光較對(duì)照組明顯降低，這表

17、明組胺通過組胺受體2增加線粒體膜的通透性，進(jìn)而使線粒體中的鈣黃綠素溢出到胞漿被氯化鈷淬滅。在培養(yǎng)基中加入組胺受體2阻斷劑法莫替丁或ERK抑制劑U0126抑制線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的開放。鈣黃綠素和MitoTracker雙染的結(jié)果以及MitoTracker的流式結(jié)果同樣也顯示組胺和AD刺激24 h后心肌細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生去極化，組胺受體2阻斷和ERK抑制能減輕線粒體膜電位的降低。這些結(jié)果表明組胺通過激活組胺受體2增加線粒體膜的通透性和去極化。

18、
　　 6.組胺通過激活組胺受體2增加單層臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與對(duì)照組相比，跨膜電阻測量的數(shù)據(jù)顯示1μM組胺刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞3h內(nèi)，其通透性明顯增加，組胺受體2阻斷劑法莫替丁能逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)(P＜0.05)。免疫印跡顯示1μM的組胺或AD增加臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2和moesin的磷酸化水平，這一改變能被組胺受體2阻斷劑法莫替丁和ERK抑制劑U0126阻斷(P＜0.05)，提示ERK1/2和moesin可能參與了通透性的改變

19、。
　　 7.組胺受體2激活介導(dǎo)小鼠心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞凋亡免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組（WT-sham）相比，在心肌缺血45分鐘再灌注24小時(shí)后，對(duì)照組(WT-control)小鼠心肌中MPO和caspase3的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)，組胺受體2特異性激動(dòng)劑AD注射組(WT-AD)心肌中MPO和caspase3的表達(dá)水平進(jìn)一步增高，而組胺受體2阻斷劑法莫替丁腹腔注射組(WT-fam)和組胺受體2基因敲除組（

20、KO-control）心肌組織中的MPO和caspase3的表達(dá)水平均較對(duì)照組降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明組胺受體2的激活介導(dǎo)了缺血再灌注時(shí)心肌的中性粒細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞的凋亡。
　　 8.組胺受體2阻斷或敲除減少心梗面積心肌缺血45 min再灌注24 h導(dǎo)致野生型小鼠心肌產(chǎn)生15％左右的壞死，而腹腔注射組胺受體2阻斷劑法莫替丁或組胺受體2基因敲除均顯著減少心肌梗死面積(P＜0.05)。相反，腹腔注射組胺受體2激動(dòng)劑AD則

21、增加心肌梗死面積至20％左右。同時(shí)，在小鼠心肌缺血24小時(shí)的動(dòng)物模型中也觀察到類似的趨勢。此外，心肌缺血45min再灌注24 h后心臟組織蛋白免疫印跡結(jié)果顯示缺血再灌注能增加ERK1/2和DAPK2的磷酸化水平和增加bax的線粒體表達(dá)，而組胺受體2基因敲除能減少它們的表達(dá)水平（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.急性心梗病人血清中組織胺濃度可高達(dá)32.9 ng/mL，較正常人和不穩(wěn)定性心絞痛病人顯著增高，提示組胺濃

22、度可作為診斷急性心梗的一個(gè)重要的指標(biāo)。
　　 2.組胺通過激活組胺受體2促進(jìn)心肌細(xì)胞胞漿中bax的線粒體轉(zhuǎn)位和p-ERK1/2的聚集，分別增加caspase3的釋放和DAPK2的磷酸化水平，從而介導(dǎo)線粒體依賴途徑和非線粒體依賴途徑的心肌細(xì)胞的凋亡。
　　 3.組胺通過組胺受體2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變，從而加劇缺血再灌注過程中中性粒細(xì)胞的浸潤，其機(jī)制與TNF-α、ERK1/2和moesin的激活有關(guān)。
　　 4.心