調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植對實(shí)驗(yàn)動物腦缺血損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:腦缺血損傷可誘發(fā)強(qiáng)大的免疫炎癥反應(yīng)。免疫系統(tǒng)與缺血的腦組織之間的相互作用參與了腦中風(fēng)的病理形成，因而成為了中風(fēng)治療的一個新靶點(diǎn)。近期的研究提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)作為一種自身的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其功能障礙可加重腦缺血后的腦損傷，因此可能是機(jī)體對抗腦缺血損傷后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的一種內(nèi)源性的自身保護(hù)機(jī)制。然而，目前尚未有研究對外源性給予調(diào)節(jié)性T細(xì)胞靜脈移植輸注是否

2、可對腦缺血損傷起到保護(hù)作用進(jìn)行過評估。故本研究擬1）明確調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的靜脈移植輸注在嚙齒類動物腦缺血模型中的神經(jīng)保護(hù)作用;2）探討潛在的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法:免疫磁珠雙重選擇細(xì)胞提取法提取健康成年C57BL/6J小鼠及SD大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。線栓法制備小鼠及大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，缺血60分鐘（小鼠）或120分鐘（大鼠）后再灌注。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(Sham)、腦梗死組(MCAO)，

3、腦梗死組又分為靜脈輸注PBS組，靜脈輸注脾細(xì)胞(splenocytes，Sp)組和靜脈輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)治療組。分別于術(shù)后24h和72h對各組動物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評價，并在MCAO后3天，7天及28天對腦切片進(jìn)行TTC染色或MAP2免疫組化染色，計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死體積。各組動物于靜脈輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h以及72h后經(jīng)心臟取血并灌注后取腦制備腦組織冰凍切片，用免疫組織化學(xué)方法染色檢測外周免疫細(xì)胞在腦組織中的浸潤。用酶

4、聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β表達(dá)水平的變化。為進(jìn)一步探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用，我們聯(lián)合采用了Gr-1抗體特異性消除中性粒細(xì)胞，MMP-9基因敲除以及骨髓嵌合子技術(shù)以及體外Treg與中性粒細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)。通過流式細(xì)胞儀分析外周免疫細(xì)胞評估Treg治療對于全身免疫功能的影響。
　　結(jié)果:在小鼠局灶性腦缺

5、血模型中，MCAO后2、6或24小時后靜脈輸注提純的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可減少腦缺血后的腦梗死面積約50％，對神經(jīng)功能的改善可持續(xù)至MCAO后28天。MCAO后2小時給予Treg靜脈輸注治療具有最顯著的治療效果，且在大鼠腦缺血模型中也具有保護(hù)作用。值得一提的是腦缺血后Treg的有效治療窗可長達(dá)24小時。在腦缺血后1天，腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、外周炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)腦組織內(nèi)的浸潤以及血腦屏障的破壞顯著減輕。
　　應(yīng)用CD45.1的同類系小鼠以及細(xì)胞示蹤

6、技術(shù)，我們驚喜地發(fā)現(xiàn)Treg的神經(jīng)保護(hù)作用并不需要其浸潤至腦組織內(nèi)或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，提示其可能在外周循環(huán)中發(fā)揮保護(hù)作用。應(yīng)用Gr-1抗體中和消除體內(nèi)中性粒細(xì)胞，基因敲除MMP-9或?qū)MP-9基因敲除的骨髓轉(zhuǎn)移至野生型經(jīng)照射的小鼠體內(nèi)都可消除Treg的神經(jīng)保護(hù)作用，顯示Treg是通過抑制外周中性粒細(xì)胞來源的基質(zhì)金屬蛋白酶-9的產(chǎn)生，從而防止了血腦屏障的破壞。Treg與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Treg是通過細(xì)胞間相互接