基于功能化納米材料和Aptamer的細(xì)胞、活體層面腫瘤成像研究.pdf

1、目前，惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。探索腫瘤早期診斷及預(yù)后監(jiān)測新方法，特別是通過細(xì)胞和活體水平上的非侵入式、原位、實時成像與表征揭示其發(fā)生發(fā)展過程中的規(guī)律和機(jī)制，對于患者治愈率和生存率的提高具有十分重要的意義。近年來，納米技術(shù)和分子工程技術(shù)等的快速發(fā)展及其與生命科學(xué)的不斷交叉融合，為開發(fā)新型腫瘤成像與表征方法提供了契機(jī)。一方面，多種多樣的功能化納米材料由于具有獨特的信號發(fā)生和增強效應(yīng)，為實現(xiàn)在

2、克服背景干擾的前提下生物標(biāo)記“靶子”的放大提供了可能;另一方面，逐漸興起和不斷豐富的腫瘤特異性Aptamer（核酸適配體）探針則由于具有傳統(tǒng)生物抗體所不具備的諸多優(yōu)越性能，為滿足臨床應(yīng)用體系的選擇性需求提供了一類理想的靶向識別分子。基于此，本論文即瞄準(zhǔn)新型腫瘤成像與表征技術(shù)發(fā)展所面臨的信號放大、靶向識別、信號激活和多功能化等問題與挑戰(zhàn)，利用功能化納米材料和Aptamer的優(yōu)勢，設(shè)計和構(gòu)建了一系列新型探針，并從亞細(xì)胞、細(xì)胞水平到活體層面系

3、統(tǒng)開展了靈敏、特異、原位、實時的腫瘤熒光成像與表征研究。具體包括以下工作:
　　 一、基于二氧化硅熒光納米顆粒新型標(biāo)記物的腫瘤細(xì)胞溶酶體定位與示蹤成像研究
　　 為克服傳統(tǒng)染料標(biāo)記物所存在的信號強度低、易光漂白、標(biāo)記壽命短等缺陷，滿足細(xì)胞水平生命活動的實時、原位、動態(tài)和長時間成像與表征要求，利用二氧化硅熒光納米顆粒(DSiNPs)的優(yōu)越性能，在系統(tǒng)開展不同表面電荷DSiNPs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的被動靶向定位與成像研究基礎(chǔ)上，發(fā)

4、展了一種新型腫瘤細(xì)胞溶酶體表征與示蹤方法。首先采用反向微乳液法以四甲基羅丹明(TAMRA)為核，成功制備了粒徑相當(dāng)而表面電荷完全相反的兩種DSiNPs。通過顆粒的熒光信號同步指示作用，結(jié)合細(xì)胞器常規(guī)標(biāo)記物進(jìn)行熒光共定位成像研究結(jié)果表明，表面帶正電荷的TAMRA-NH2-DSiNPs由于緩沖容量較大，在進(jìn)入溶酶體后呈現(xiàn)出部分逃逸和被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲的特點;而表面帶負(fù)電荷的TAMRA-DSiNPs則可長時間滯留于溶酶體中。隨后以Hela宮頸癌細(xì)胞

5、為模型，經(jīng)條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，TAMRA-DSiNPs能特異性定位于溶酶體內(nèi)，且標(biāo)記性能不受核材料限制，有望用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多色熒光成像研究。尤其與常規(guī)標(biāo)記物(包括大分子Alexa488-dextran和小分子LysoTracker Green)相比，其不僅具有光穩(wěn)定性強、循環(huán)壽命長且生物相容性好等一系列優(yōu)點，而且還顯示出優(yōu)越的對細(xì)胞固定化和透化處理過程的耐受性能。最后，TAMRA-DSiNPs即被成功用于經(jīng)氯喹處理的Hela細(xì)胞內(nèi)溶酶體示

6、蹤以及多種不同細(xì)胞系的溶酶體表征研究，為其進(jìn)一步在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中溶酶體相關(guān)生命活動的成像與表征中的應(yīng)用提供了有力支持。
　　 二、基于AnnexinⅤ功能化二氧化硅熒光納米顆粒新型標(biāo)記方法的早期凋亡腫瘤細(xì)胞成像研究
　　 利用DSiNPs所具備的熒光信號強、光穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點，結(jié)合“配體-受體”相互作用，基于AnnexinⅤ功能化DSiNPs與凋亡早期細(xì)胞膜上外翻磷脂酰絲氨酸(PS)的特異性結(jié)合，發(fā)展了一種

7、靈敏、特異、穩(wěn)定而簡便的新型早期凋亡腫瘤細(xì)胞成像與表征方法。首先采用反向微乳液法以異硫氰酸羅丹明B(RBITC)為核，成功制備了包裹RBITC的二氧化硅納米顆粒(RBITC-DSiNPs)。經(jīng)TEM表征顯示，該顆粒粒徑為50±5 nm、分散性好。通過進(jìn)一步在其表面共價交聯(lián)AnnexinⅤ，成功構(gòu)建了一種主動靶向型早期凋亡腫瘤細(xì)胞識別與標(biāo)記探針。結(jié)合激光共聚焦熒光成像考察發(fā)現(xiàn)，該探針不僅可有效區(qū)分紫杉醇誘導(dǎo)的早期凋亡MCF-7乳腺癌細(xì)胞和

8、未經(jīng)處理的MCF-7細(xì)胞，還能實現(xiàn)經(jīng)藥物誘導(dǎo)不同時間的早期凋亡細(xì)胞表面PS外翻程度的原位表征與示蹤。尤其與Cy3染料標(biāo)記方法相比，該探針顯示出更為優(yōu)越的光穩(wěn)定性，在長達(dá)20分鐘的激光連續(xù)照射后，仍能保持清晰而明亮的熒光標(biāo)記信號，有望在腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)研究以及抗癌藥物的篩選等方面發(fā)揮重要作用。
　　 三、基于cell-SELEX技術(shù)篩選的Aptamer探針的腫瘤活體熒光成像研究
　　 為克服傳統(tǒng)生物抗體的局限并開發(fā)新型腫瘤

9、活體成像分子探針，采用基于cell-SELEX技術(shù)篩選的腫瘤細(xì)胞特異性Aptamer，通過直接修飾近紅外熒光染料Cy5構(gòu)建了一系列腫瘤靶向識別與標(biāo)記探針，并系統(tǒng)開展了包括血液瘤和實體瘤在內(nèi)的多種腫瘤的活體熒光成像研究。首先以Ramos淋巴瘤及其Aptamer TD05為模型，經(jīng)流式細(xì)胞分析證實，Cy5-TD05在小鼠血清中能較好地保持對體外培養(yǎng)和原代培養(yǎng)Ramos細(xì)胞的結(jié)合性能。活體熒光成像結(jié)果也表明，其不僅具有對小鼠體內(nèi)Ramos腫瘤

10、的靶向成像能力，而且還顯示出優(yōu)越的序列依賴性和腫瘤特異性。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步拓展Aptamer在肺癌、肝癌等其他類型腫瘤熒光成像中的應(yīng)用，利用其相應(yīng)Cy5標(biāo)記Aptamer探針成功實現(xiàn)了同一只小鼠體內(nèi)不同類型腫瘤的選擇性成像效果，為Aptamer作為一類新型腫瘤靶向識別分子今后在活體成像中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 四、基于鎖核酸修飾Aptamer探針的血液穩(wěn)定性改善與腫瘤活體熒光成像研究
　　 為解決Aptamer在用

11、于復(fù)雜生物體系時仍然存在的穩(wěn)定性不足、腫瘤部位滯留時間短、成像時間窗口窄等問題，以TD05為模型，采用鎖核酸(LNA)和反轉(zhuǎn)T堿基(3'-3'-T)修飾方法，成功構(gòu)建了一種同時具有靶腫瘤細(xì)胞識別能力和血液穩(wěn)定性的腫瘤成像探針。通過考察一系列不同取代組合、位置和數(shù)量的修飾策略對TD05抗酶切性能、親和力和特異性的影響發(fā)現(xiàn)，LNA和3'-3'-T的共同修飾對其血清穩(wěn)定性具有明顯的協(xié)同改善效果，且一定程度上LNA取代數(shù)越多則對Aptamer半

12、衰期的延長效果越明顯。尤其經(jīng)7對LNA取代和3'-3'-T修飾的TD05.6探針在37度血清的生理條件下顯示出長達(dá)5-6小時的識別能力半衰期，提高至修飾前的10倍以上，并成功將活體腫瘤成像時間窗口從修飾前的105分鐘延長到10小時以上。這一探針修飾策略將有望發(fā)展成為一種通用的方法為腫瘤活體成像研究提供更多具有臨床實用價值的Aptamer探針。
　　 五、基于細(xì)胞膜表面蛋白觸發(fā)構(gòu)型變化的發(fā)夾型激活式Aptamer探針的腫瘤活體熒光

13、成像研究
　　 為進(jìn)一步解決上述染料直接標(biāo)記“always on”Aptamer探針存在的診斷時間長、成像對比度不高、靈敏度有限等不足，以CCRF-CEM白血病細(xì)胞的特異性Aptamer Sgc8c為模型，巧妙地設(shè)計了一種基于細(xì)胞膜表面蛋白觸發(fā)構(gòu)型變化的發(fā)夾型激活式Aptamer探針。該探針在游離狀態(tài)下主要為發(fā)夾構(gòu)型，當(dāng)沒有目標(biāo)物存在時，探針本體兩端的熒光分子和淬滅分子相互靠近而導(dǎo)致熒光熄滅;而在與靶細(xì)胞作用后，該探針可有效發(fā)生

14、構(gòu)型重組而導(dǎo)致熒光激活，從而指示靶腫瘤細(xì)胞的存在。經(jīng)流式細(xì)胞分析證實，該探針具有對靶腫瘤細(xì)胞的高特異性信號激活性能，尤其與“always on”探針相比，可顯著提高分析靈敏度，有效檢測低至118個CCRF-CEM細(xì)胞數(shù)的樣品。而在應(yīng)用于腫瘤活體成像時，該探針則不僅可明顯降低來自非靶組織中未結(jié)合探針的信號干擾從而使腫瘤成像對比度得到明顯增強，并將診斷時間從“always on”模式的數(shù)小時縮短至15分鐘;而且還具有優(yōu)越的序列特異性和腫瘤靶

15、向性。鑒于Aptamer篩選技術(shù)對靶標(biāo)范圍的不斷拓展，這一探針設(shè)計將有望作為一種通用的方法用于發(fā)展高靈敏、高特異性的腫瘤活體成像探針。
　　 六、基于細(xì)胞膜表面蛋白觸發(fā)構(gòu)型變化的裂開型激活式Aptamer探針的腫瘤細(xì)胞和活體成像與檢測研究
　　 以Sgc8c為模型，通過在適當(dāng)位點將其分裂為兩條核酸片段，成功構(gòu)建了一種基于細(xì)胞膜表面蛋白觸發(fā)構(gòu)型變化的裂開型激活式Aptamer探針。該探針在沒有靶標(biāo)存在時，兩條游離核酸片段之

16、間不會發(fā)生明顯的相互作用;而當(dāng)體系中引入靶腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞膜表面的靶蛋白會誘導(dǎo)其形成與完整Sgc8c類似的識別構(gòu)型從而與靶細(xì)胞結(jié)合。經(jīng)流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，該探針對靶細(xì)胞的特異性親和力具有明顯的溫度敏感性。利用低溫下該探針的靶向識別性能，結(jié)合富G序列對銀納米簇的鄰近熒光增強效應(yīng)，發(fā)展了一種簡單、方便、免洗、靈敏而特異的CCRF-CEM細(xì)胞成像與檢測技術(shù)。利用溫度從冰上逐漸上升至37度時該探針與靶細(xì)胞的結(jié)合能力逐漸下降的特點，選取探針修飾的9

17、6孔板作為捕獲容器，建立了一種腫瘤細(xì)胞選擇性捕獲與溫控釋放方法;并證實該方法不僅具有良好的細(xì)胞親和性，而且可有效用于靶細(xì)胞的循環(huán)捕獲與釋放以及混合體系中不同腫瘤細(xì)胞的分離和回收。最后，通過進(jìn)一步修飾PEG linker將該探針的兩條游離核酸片段相連，使分子間作用轉(zhuǎn)換為分子內(nèi)作用，成功克服了其在生理條件下容易失活的難題，并結(jié)合Cy3-Cy5供受體對的FRET效應(yīng)初步展示了一定的腫瘤細(xì)胞檢測與成像可行性。
　　 七、基于腫瘤酸性微環(huán)

18、境刺激響應(yīng)的pH激活式Aptamer探針的腫瘤細(xì)胞和活體熒光成像研究
　　 針對腫瘤組織的弱酸性特點以及腫瘤細(xì)胞溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境(pH4-6)，同時結(jié)合Aptamer的靶向識別性能，以A549肺癌細(xì)胞的特異性Aptamer S6為模型，利用可在低pH條件下水解的ATU(3，9-雙(3-氨丙基)-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]十一烷）小分子將Cy5標(biāo)記Aptamer與熒光淬滅分子BHQ3相連，成功構(gòu)建了一種同時具備檢測特異

19、性和“signal on”信號模式的pH激活式Aptamer探針。該探針在中性環(huán)境中的熒光淬滅效率高達(dá)約98％，而當(dāng)置于pH4.5的緩沖液中24小時即可發(fā)生幾乎100％信號恢復(fù)。通過與發(fā)夾型激活式Aptamer探針比較發(fā)現(xiàn)，該探針無論在小鼠血清中還是裸鼠體內(nèi)，均顯示出優(yōu)越的熒光穩(wěn)定性。激光共聚焦顯微成像結(jié)果則表明，該探針不僅具備在活細(xì)胞溶酶體內(nèi)的定點酸性激活性能，而且與“always on”探針相比，具有成像特異性高、對比度高、簡單、免

20、洗等一系列優(yōu)點。進(jìn)一步的活體腫瘤熒光成像結(jié)果也證實，該探針完全具備在裸鼠體內(nèi)腫瘤組織中發(fā)生信號激活的成像性能，且該激活行為具有高度的序列特異性和腫瘤靶向性，有望發(fā)展成為一種通用探針設(shè)計平臺用于腫瘤等酸性疾病區(qū)域的表征和成像研究。
　　 八、基于Aptamer-碳納米管自組裝激活式探針的腫瘤活體熒光成像研究
　　 結(jié)合功能化納米材料和Aptamer分別作為信號轉(zhuǎn)換器件和靶向識別分子的優(yōu)勢，以SgcSc為模型，利用單壁碳納米

21、管(SWNTs)對熒光標(biāo)記DNA的強吸附性能和高效淬滅作用，成功構(gòu)建了一種基于Aptamer-碳納米管自組裝功能體的激活式腫瘤成像探針。當(dāng)體系中不存在靶標(biāo)時，Cy5-Sgc8c牢固附著于SWNTs表面，Cy5熒光被淬滅;而在加入靶腫瘤細(xì)胞后，由于Aptamer與細(xì)胞表面的靶蛋白結(jié)合使Cy5離開SWNTs表面，熒光得以恢復(fù)。通過流式細(xì)胞術(shù)、活體熒光成像技術(shù)等考察發(fā)現(xiàn)，無論是在緩沖液體系中還是裸鼠移植瘤模型內(nèi)，CCRF-CEM細(xì)胞均可有效激

22、活該探針的熒光信號，且激活性能具有高度的序列特異性和腫瘤靶向性。尤其通過與“always on”探針對比證實，SWNTs可有效降低非靶體系中未結(jié)合探針的非特異性信號背景干擾，從而明顯改善靶腫瘤細(xì)胞的體外分析信倍比和活體成像對比度。這一探針設(shè)計簡單方便，有望發(fā)展成為一種低背景、高對比、高特異且具有普遍適用性的腫瘤成像方法。
　　 九、基于激活式Aptamer探針功能化Au@Au/Ag納米顆粒的腫瘤活體熒光成像及其引導(dǎo)下的近紅外光熱

23、治療研究
　　 在上述基于激活式Aptamer探針(AAP)的腫瘤活體成像研究基礎(chǔ)上，結(jié)合功能化納米材料的腫瘤殺傷性能，初步探討了基于Aptamer-納米材料功能組裝體的“診療一體化”探針構(gòu)建與應(yīng)用研究。首先以金納米棒(Au NRs)為模板，采用先包銀后刻蝕金的方法成功合成了Au@Au/Ag球形納米顆粒(Au@Au/AgNPs)。該顆粒在400-1100 nm范圍內(nèi)顯示出強烈的光吸收性能，且在980 nm光激發(fā)下具有較Au NR

24、s高約4.5倍的產(chǎn)熱效率。隨后，利用該顆粒同時作為光熱轉(zhuǎn)換元件和熒光淬滅元件，并以S6為模型設(shè)計競爭型AAP序列，通過“Au-S”作用下顆粒與DNA的自組裝行為，成功構(gòu)建了基于AAP功能化Au@Au/Ag NPs的“診療一體化”多功能探針。經(jīng)過一系列體內(nèi)外考察證實，該探針不僅具有對靶腫瘤細(xì)胞的選擇性光熱治療效果，而且可有效實現(xiàn)對體內(nèi)外靶腫瘤細(xì)胞的激活式成像與檢測。進(jìn)一步以尾靜脈注射方式將該探針導(dǎo)入植有不同腫瘤的裸鼠體內(nèi)，成功實現(xiàn)了對A5