黑線倉鼠KiSS-1-GPR54系統(tǒng)在季節(jié)性繁殖調(diào)控中的作用機(jī)制.pdf

1、我國為傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物種類多，且分布廣。農(nóng)作物所遭受到的生物災(zāi)害復(fù)雜多樣，危害嚴(yán)重，如鼠害的發(fā)生已對農(nóng)牧業(yè)發(fā)展以及人類生活健康造成了嚴(yán)重威脅。因此，要想從根源上治理鼠害，需使用有效的分子生物學(xué)或生態(tài)平衡等措施，更便捷、更具有針對性的防治鼠害。黑線倉鼠（Cricetulus barabensis）是我國華北地區(qū)典型的害鼠之一，其繁殖方式具有伴隨季節(jié)周期性轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)以黑線倉鼠為研究對象，既是研究哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖的良好材料，又為

2、治理鼠害提供理論依據(jù)。本研究以分子生物學(xué)方法和技術(shù)，研究與繁殖相關(guān)的中樞調(diào)控基因KiSS-1及其受體GPR54的表達(dá)模式，以揭示KiSS-1/GPR54調(diào)控通路在連接光照等季節(jié)性因素和繁殖機(jī)制中所起到的主要作用。
　　首先，采用RT-PCR方法克隆黑線倉鼠GPR54基因全部cDNA序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對與其配體KiSS-1的相互作用方式進(jìn)行探究，以便通過兩者的結(jié)合作用模式了解KiSS-1/GPR54調(diào)控通路的功能位點(diǎn)?？寺～@

3、得黑線倉鼠GPR54基因序列1102bp，其中包括全部編碼區(qū)序列939bp（GenBank登錄號：KF006323）。對GPR54基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析可知，翻譯共獲得213個(gè)氨基酸，對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明整體疏水性較強(qiáng)。將所獲得的GPR54氨基酸序列與小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）等相應(yīng)序列相比對，發(fā)現(xiàn)存在240bp左右的片段缺失，使用Pred

4、ictProtein工具預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，僅能預(yù)測出黑線倉鼠GPR54氨基酸序列的6次跨膜結(jié)構(gòu)，不具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體7次跨膜，推測可能是由于缺失片段造成了跨膜區(qū)域的中斷，并與其配體KiSS-1的特異性識別位點(diǎn)結(jié)合有關(guān)。使用MEGA5.0軟件對所獲得的GPR54 mRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，所獲結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果一致。
　　其次，檢測外源褪黑激素對黑線倉鼠中樞神經(jīng)和外周性腺KiSS-1/GPR54系統(tǒng)以及GnRH的表達(dá)模式，驗(yàn)

5、證KiSS-1/GPR54系統(tǒng)在生殖活動(dòng)中起到的作用。本研究采用外源褪黑激素注射（15天）的方式，且注射期間對黑線倉鼠的體重進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。雌雄處理組的體重在進(jìn)行褪黑激素注射后分別于第9日和第12日開始顯著低于對照組。處死后對臟器系數(shù)進(jìn)行檢測，對照組與處理組黑線倉鼠的副性器官（子宮、附睪）具有顯著差異（p<0.05），而性腺系數(shù)差異不顯著（p>0.05）。隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對黑線倉鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周性腺KiSS-1、GP

6、R54 mRN A的表達(dá)差異進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：處理組下丘腦中KiSS-1基因表達(dá)量顯著低于對照組（p<0.05），雌雄黑線倉鼠的性腺KiSS-1及其受體GPR54表達(dá)量也具有顯著性差異（p<0.05），提示褪黑激素可能通過對KiSS-1/GPR54系統(tǒng)的抑制從而進(jìn)一步抑制黑線倉鼠的繁殖活性，此系統(tǒng)可能是介導(dǎo)光照和黑線倉鼠繁殖的重要調(diào)控通路。對下丘腦GnRH的表達(dá)模式進(jìn)行檢測表明，對照組與處理組的GnRH的表達(dá)量也存在顯著差異（p<0

7、.05），且均于下丘腦KiSS-1 mRNA表達(dá)趨勢相一致。推測，KiSS-1、GPR54以及GnRH都是作用于下丘腦-垂體-性腺軸進(jìn)而調(diào)控繁殖活性的重要因子。
　　最后，對自然季節(jié)黑線倉鼠KiSS-1、GPR54基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，并使用激素含量檢測和實(shí)時(shí)熒光定量兩種方式，驗(yàn)證了黑線倉鼠KiSS-1/GPR54系統(tǒng)對繁殖活動(dòng)的季節(jié)性調(diào)控及生殖發(fā)育的作用。其中，對血清中褪黑激素和Kisspeptin的含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)光周期作為

8、調(diào)節(jié)因子發(fā)揮了重要作用。對中樞神經(jīng)下丘腦KiSS-1基因的表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)雌雄黑線倉鼠均為夏季表達(dá)量最高，GPR54的表達(dá)則有性別差異，雌性為冬季顯著低于其他三個(gè)季節(jié)（p<0.05），雄性則表現(xiàn)為夏季顯著性低表達(dá)（p<0.05）。對外周性腺檢測發(fā)現(xiàn)，卵巢KiSS-1和GPR54表達(dá)量均呈現(xiàn)出春季顯著高表達(dá)（p<0.05），睪丸中則呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式，即春、秋季節(jié)KiSS-1表達(dá)量顯著高于夏、冬季（p<0.05），而GPR54的表達(dá)量為春

9、、秋季低于夏、冬季，表現(xiàn)一種對其配體KiSS-1代償性的增加。綜合推斷，下丘腦的表達(dá)模式可能更趨向于受到外界環(huán)境因子調(diào)控，性腺的表達(dá)則更多的與黑線倉鼠的繁殖活動(dòng)的季節(jié)循環(huán)周期相一致，而雌雄性腺KiSS-1 mRNA所呈現(xiàn)的不同的表達(dá)模式，推測是由于下丘腦不同核區(qū)對性激素的正負(fù)反饋機(jī)制存在性別差異，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出的不同信號對機(jī)體的繁殖調(diào)控產(chǎn)生了雌雄表達(dá)模式差異。
　　綜上所述，本研究通過自然季節(jié)取樣和褪黑激素處理兩種方法證實(shí)了K