清開靈注射液致小鼠IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)模型建立與綠原酸變應(yīng)原性研究.pdf

1、清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、鎮(zhèn)靜安神和醒腦開竅的功效，在臨床上使用廣泛。但隨著臨床應(yīng)用日益增多，清開靈注射液的不良反應(yīng)報告也逐漸增加，不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為用藥30 min內(nèi)即可發(fā)生藥物熱、皮膚反應(yīng)或過敏性休克，其中重癥過敏反應(yīng)嚴(yán)重限制了清開靈注射液的臨床應(yīng)用。因此，找出清開靈注射液中致重癥過敏反應(yīng)的主要物質(zhì)，是保障清開靈注射液安全使用的關(guān)鍵。
　　 目前，國內(nèi)學(xué)者對清開靈注射液致類過敏反應(yīng)研究較為透徹，初步發(fā)現(xiàn)了梔子、金銀

2、花提取物和膽酸可能是引起類過敏反應(yīng)的物質(zhì);而清開靈注射液致IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)仍處于初級階段，僅僅建立了一些簡單的BN大鼠速發(fā)過敏模型;不少學(xué)者通過碳二亞胺法制備綠原酸完全抗原，發(fā)現(xiàn)綠原酸可能可以作為一種半抗原引發(fā)免疫應(yīng)答，還有不少學(xué)者則認(rèn)為綠原酸并非半抗原，而是其中的雜質(zhì)物-異綠原酸為半抗原，顯然，僅有一種偶聯(lián)方法并不足以說明綠原酸具有變應(yīng)原性。
　　 因此，本研究擬對清開靈注射液致IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)動物模型進(jìn)行深入研究，并

3、利用建立此模型的技術(shù)路線對具有爭議性的綠原酸進(jìn)行變應(yīng)原性驗(yàn)證研究，為篩查出清開靈注射液中致重癥過敏反應(yīng)的主要物質(zhì)、保障清開靈注射液安全使用奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、建立清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)模型，為后續(xù)篩查清開靈注射液中致重癥過敏反應(yīng)的主要物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　 2、利用建立IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)動物模型的技術(shù)路線對綠原酸進(jìn)行變應(yīng)原性研究。
　　 方法:
　　 1

4、、清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)模型的建立
　　 (1)陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)的制備及鑒定:將牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相關(guān)合成方法制備cBSA，然后采用陽離子交換法對完全抗原進(jìn)行分離純化，同時輔以紫外分光光度法(UV-Vis)和紅外光譜法(FT-IR)進(jìn)行鑒定。
　　 (2)清開靈-cBSA完全抗原的制備及鑒定:利用Mannich反應(yīng)將清開靈注射液凍干粉偶聯(lián)至cBSA上制

5、備完全抗原，然后采用陽離子交換法對完全抗原進(jìn)行分離純化，同時輔以UV-Vis和FT-IR進(jìn)行鑒定。
　　 (3)清開靈-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠實(shí)驗(yàn):將18只Balb/c小鼠隨機(jī)分成3組:清開靈-cBSA偶聯(lián)物+鋁佐劑（實(shí)驗(yàn)組），OVA+鋁佐劑組（陽性對照組），生理鹽水組（陰性對照組）。實(shí)驗(yàn)組多點(diǎn)皮下注射0.3 mL偶聯(lián)物與佐劑的混合物（含0.05 mg偶聯(lián)物），其他組以等劑量多點(diǎn)皮下注射。在初次免疫后第14d、21

6、d、28d、35d，以相同劑量皮下注射加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后30 min內(nèi)觀察小鼠體征表現(xiàn)，參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分統(tǒng)計，同時眼后眥靜脈采血約0.5 ml，分離出來的血清-20℃儲藏，用于血清中組胺和總IgE的含量測定。第35d取實(shí)驗(yàn)組、生理鹽水組小鼠全血并解剖，將肺組織置于10％的甲醛中，用于病理切片檢查。
　　 (4)小鼠血清中總IgE、組胺的含量測定:將各時間點(diǎn)的小鼠血清按照試劑盒說明書進(jìn)行IgE、組胺含量測定，然后采用On

7、e-Way ANOVA方法，比較不同組別間是否有差異。
　　 (5)小鼠肺部組織病理切片觀察:將肺組織用10％甲醛固定，然后包埋于石蠟中，切片成5μl厚，再用H&E染色，最后置于100X電鏡下拍照。
　　 2、綠原酸變應(yīng)原性研究
　　 (1)陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)的制備及鑒定:將牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相關(guān)合成方法制備cBSA，然后采用陽離子交換法對完全抗原進(jìn)行分離純化，同時輔以UV

8、-Vis、FT-IR和基質(zhì)輔助-激光解吸-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法進(jìn)行鑒定。
　　 (2)綠原酸-cBSA完全抗原的制備及鑒定:利用Mannich反應(yīng)將綠原酸偶聯(lián)至cBSA上制備完全抗原，然后采用陽離子交換法對完全抗原進(jìn)行分離純化，同時輔以UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法進(jìn)行鑒定。
　　 (3)綠原酸-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠實(shí)驗(yàn):將6只Balb/c小鼠隨機(jī)分成2組:偶聯(lián)

9、物1、偶聯(lián)物2組。實(shí)驗(yàn)組多點(diǎn)皮下注射0.3 mL偶聯(lián)物與鋁佐劑的混合物（含0.1 mg偶聯(lián)物）。在初次免疫后每隔2周以相同劑量皮下注射加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后30 min內(nèi)觀察小鼠體征表現(xiàn)，進(jìn)行評分統(tǒng)計;實(shí)驗(yàn)組初免前1d靜脈后眼眶采血0.5 ml作陰性對照，第三次加強(qiáng)免疫后取全血;采集的血先室溫靜置30 min，然后4℃，2000 rmp離心10 min，分離出來的血清-20℃儲藏，用于抗血清的效價測定。
　　 (4)小鼠抗血清

10、效價測定:包被96孔酶標(biāo)板，4℃孵育過夜;用含1％nBSA的PBS溶液于37℃封閉，加入不同稀釋度的抗血清，37℃孵育，加入羊抗鼠酶標(biāo)抗體，37℃孵育，加TMB雙液，于37℃反應(yīng)20 min，然后加終止液，用酶標(biāo)儀讀出各孔在450 nm處的吸光度值。陰性對照用未免疫過的小鼠血清，空白對照為PBS。每一稀釋比的供試品設(shè)置3個平行孔。血清供試品的A450 nm值(P)與陰性對照的A450 nm值(N)之比(P/N)大于2即為陽性，反之則為陰

11、性，以P/N大于2的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價。
　　 結(jié)果:
　　 1、清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)模型建立
　　 通過對nBSA進(jìn)行陽離子化修飾，應(yīng)用Mannich反應(yīng)制備清開靈-cBSA完全抗原，陽離子交換法分離純化，并利用UV-Vis、FT-IR對其進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明清開靈-cBSA偶聯(lián)成功;用清開靈-cBSA偶聯(lián)物刺激小鼠后，小鼠出現(xiàn)瘙癢、立毛、扭體等過敏體征;與陰性對照組

12、比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠各個時間點(diǎn)的血清中總IgE、組胺含量均升高(P＜0.01，P＜0.05);與陽性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠各個時間點(diǎn)的血清中總IgE、組胺含量并無顯著性差異(P＞0.05);肺部組織病理切片顯示肺部受到明顯損傷:肺泡融合、中性粒細(xì)胞浸潤、肺部充血、氣管壁有輕度破損;以上各項(xiàng)指標(biāo)都說明清開靈-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠發(fā)生IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，模型建立成功。
　　 2、綠原酸變應(yīng)原性研究
　　 通過

13、對nBSA進(jìn)行陽離子化修飾，應(yīng)用Mannich反應(yīng)制備綠原酸-cBSA完全抗原，陽離子交換法分離純化，并利用UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法對其進(jìn)行鑒定，三種鑒定結(jié)果均表明綠原酸-cBSA偶聯(lián)成功;用清開靈-cBSA偶聯(lián)物刺激小鼠后，小鼠出現(xiàn)瘙癢、立毛、扭體等過敏體征;同時，兩實(shí)驗(yàn)組小鼠均成功獲得了針對特異性綠原酸的抗血清，且效價均為1:4000。
　　 結(jié)論:
　　 通過將nBSA進(jìn)行修飾，然后利用

14、Mannich反應(yīng)制備清開靈-cBSA完全抗原，受刺激后的小鼠出現(xiàn)瘙癢、立毛、扭體等過敏體征，血清總IgE、組胺升高，肺部病理切片顯示肺泡融合、充血、氣管壁破損，說明清開靈-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠發(fā)生IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，利用該技術(shù)路線建立清開靈注射致Balb/c小鼠IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)模型是可行的。同時，利用該技術(shù)路線成功制備綠原酸-cBSA完全抗原，并獲得了高效價的抗血清，更進(jìn)一步說明了綠原酸可作為半抗原引發(fā)免疫應(yīng)答