扇貝多肽經(jīng)由P16和RASSF1A基因甲基化抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：建立模擬日光紫外線B輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病理模型，從Gadd45a、DNMTs、P16和RASSF1A基因甲基化的角度，研究扇貝多肽(PCF)抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，為扇貝多肽防治UVB輻射致皮膚癌提供理論依據(jù)。
　　方法：采用CCK8法篩選并確定UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的單次輻射劑量，Gimsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)初步確立UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的終點(diǎn)，軟瓊脂克

2、隆形成實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9蛋白酶的分泌證明UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的成功。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為4組:正常對(duì)照組、UVB模型組、UVB+2.84mmol/LPCF、UVB+2.84mmol/L維生素C陽性對(duì)照組。經(jīng)平板集落形成實(shí)驗(yàn)，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期確立PCF對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的抑制作用;RT-PCR檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)mRNA經(jīng)時(shí)(

3、UVB輻射4、8、16、20次)表達(dá);蛋白印跡法檢測(cè)GADD45a、DNMT3b、P16及RASSF1A蛋白經(jīng)時(shí)(UVB輻射4、8、12、16、20次)表達(dá)。以高分辨率溶解曲線(MS-HRM)檢測(cè)PCF對(duì)處于UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化各階段（4次、12次、20次）中P16、RASSF1A基因甲基化的程度。
　　結(jié)果:UVB(波長(zhǎng)峰值297nm)照射的輻照強(qiáng)度約在11uw/cm2，單次輻射劑量10 mJ/cm2，輻射次數(shù)20

4、次，總輻射劑量200 mJ/cm2時(shí)，成功建立UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型;2.84 mmol/LPCF比VC更明顯抑制UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化(P＜0.05)。DNMT1和DNMT3amRNA的經(jīng)時(shí)表達(dá)顯示UVB輻射HaCaT細(xì)胞DNMT1和DNMT3a的表達(dá)量與輻射前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);DNMT3b的mRNA和蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，UVB輻射20次后其表達(dá)量達(dá)到高峰(P＜0.05

5、);Gadd45a蛋白經(jīng)時(shí)變化顯示UVB輻射4次時(shí)即可檢測(cè)表達(dá)量達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量逐漸下降，UVB輻射20次后蛋白表達(dá)到低谷(P＜0.05); P16和RASSF1A蛋白經(jīng)時(shí)變化顯示UVB輻射后表達(dá)量逐漸下降，UVB輻射20次后蛋白表達(dá)到低谷(P＜0.05); PCF和VC均可抑制P16和RASSF1A基因的甲基化(P＜0.05)，促進(jìn)P16、RASSF1A和GADD45a蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，抑制DNMT3b蛋白的表達(dá)(P＜0