氟西汀合并乳腺癌化療藥物臨床應(yīng)用的藥理基礎(chǔ).pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌是全世界婦女最常見的惡性腫瘤之一，在我國，乳腺癌的發(fā)病率也在逐年上升。腫瘤和抑郁相關(guān)性的長期隨訪研究證實二者共病例比較高。由于乳腺位置的特殊性，使得乳腺癌并發(fā)抑郁障礙的發(fā)生率尤為突出，國內(nèi)外研究顯示乳腺癌病人中抑郁的癥狀呈現(xiàn)率大約在10-30％，抑郁障礙會嚴重影響患者的依從性、降低其生活質(zhì)量及預后、甚至影響化療藥物的藥代動力學從而影響藥物的治療效果。因此臨床對乳腺癌伴發(fā)抑郁癥的患者在化療同時進行抗抑郁治療

2、。氟西汀便是其中之一，臨床研究顯示，接受氟西汀治療的患者其抑郁癥狀明顯得到緩解、生活質(zhì)量明顯提高。
　　 腫瘤化療失敗最主要的一個原因就是存在多藥耐藥(multidrugresistanceMDR)。多藥耐藥性是指抗某種細胞毒藥的耐藥細胞對許多結(jié)構(gòu)上無關(guān)和作用機制上不同的其他細胞毒藥物產(chǎn)生交叉耐藥。腫瘤MDR形成涉及以下四大機制:一、藥物轉(zhuǎn)運:藥物轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白(P-glycoproteinP-gp)及其編碼基因MDR1基因

3、，P-gp是研究的最多也是MDR形成最主要的蛋白;二、藥物代謝:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneSepoxidetransferaseGST），其中GST同工酶π（GST-π）與腫瘤耐藥及疾病進展密切相關(guān);三、細胞凋亡基因:對那些通過誘導凋亡來殺傷腫瘤細胞的抗腫瘤藥物，細胞凋亡基因的調(diào)控也與MDR發(fā)生息息相關(guān)，這其中就包括正向調(diào)控基因p53和負向調(diào)控基因Bcl-2;四、藥物靶:拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ，topo

4、Ⅱ)，topoⅡ的定量或定性改變均影響藥物療效，這種類型的耐藥稱為不典型MDR。
　　 乳腺癌的多藥耐藥在臨床上也十分常見，逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療的多藥耐藥問題是乳腺癌治療中亟待解決的問題。近年來對腫瘤化療MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究越來越多，尋找低毒高效的逆轉(zhuǎn)劑是研究的目標。以往的三代MDR逆轉(zhuǎn)劑由于不良反應(yīng)嚴重、溶解性差以及達到逆轉(zhuǎn)耐藥效果所需劑量大等原因而在臨床應(yīng)用受限。近年來有研究發(fā)現(xiàn)新型抗抑郁藥氟西汀(Fluoxetine，F(xiàn)LX)可逆

5、轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥，有望成為第四代腫瘤化療的增敏劑或MDR逆轉(zhuǎn)劑。
　　 目前，乳腺癌化療方案中合用氟西汀已成為常規(guī)。但這種臨床合并用藥的藥理基礎(chǔ)尚無系統(tǒng)研究。本課題將研究常用的乳腺癌化療藥物阿霉素(AdriamycinADM)、紫杉醇(PaclitaxelPTX)與合用氟西汀后對乳腺癌細胞的藥理作用及機制，為臨床乳腺癌化療藥物合并氟西汀的臨床應(yīng)用提供藥理學依據(jù)。
　　 本研究擬從兩方面探討氟西汀對乳腺癌細胞的增敏或逆

6、轉(zhuǎn)耐藥作用。一方面我們從氟西汀誘導凋亡這一設(shè)想出發(fā)，研究聯(lián)合氟西汀前后細胞凋亡的變化，以及凋亡相關(guān)基因抑癌基因p53、抑凋亡基因Bcl-2的表達有無差異。另一方面，直接研究多藥耐藥P-gp基因和蛋白的表達以及GST-π的表達，探討氟西汀聯(lián)合使用前后P-gp及GST-π的表達有無改變;從而闡明氟西汀逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的分子機制。
　　 研究目的:
　　 1.細胞水平檢測化療藥物單獨使用以及合并使用氟西汀對人乳腺癌細胞敏感株

7、MCF-7及耐藥株細胞MCF-7/ADM的細胞毒性作用。
　　 2.流式細胞術(shù)檢測氟西汀聯(lián)合使用前后對細胞凋亡的影響。
　　 3.在分子水平對p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白以及MDR1mRNA表達進行檢測，探討氟西汀逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的分子機制。
　　 實驗方法:
　　 1.MTT法檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細胞增殖抑制的影響
　　 倍比稀釋氟西汀母液至80、40、20、10、5、2.

8、5μg/ml的工作濃度;同樣的稀釋阿霉素至80、40、20、10、5、2.5μg/ml和4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml;紫杉醇至16、8、4、2、1、0.5μg/ml。進行MTT實驗，加藥72h后檢測細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率小于10％范圍內(nèi)選擇氟西汀的適宜濃度作為聯(lián)合用藥濃度，紫杉醇和阿霉素的用藥濃度不變再次進行MTT實驗。計算阿霉素、紫杉醇聯(lián)合氟西汀前后的IC50值，得出氟西汀的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。t檢驗比較聯(lián)合用藥前

9、后IC50值及阿霉素、紫杉醇單獨作用MCF-7/ADM和MCF-7兩細胞IC50值的差異顯著性。
　　 2.流式細胞術(shù)檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細胞凋亡的影響
　　 根據(jù)MTT實驗結(jié)果以IC50值為參考，分別選擇低、高兩濃度作為后續(xù)聯(lián)合用藥的藥物濃度:1,4μg/ml作為紫杉醇聯(lián)合氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7細胞的兩個梯度濃度;5，20μg/ml作為阿霉素作用MCF-7/ADM的聯(lián)合用藥濃度;0.5，2μg/m

10、l作為阿霉素作用MCF-7的聯(lián)合用藥濃度。氟西汀聯(lián)合用藥濃度固定為5μg/ml。兩細胞經(jīng)10個藥物處理組:control、PTX(l)、PTX(h)、FLX-PTX(l)、FLX-PTX(h)、ADM(l)、ADM(h)、FLX-ADM(l)、FLX-ADM(h)、FLX處理24h后，AnnexinV-PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。采用one-wayANOVA統(tǒng)計方法，并根據(jù)方差齊性與否采用Dunnett或Dunnett'sT3檢

11、驗法進行組間多重比較，比較各單獨用藥組凋亡率與空白組水平差異顯著性，以及t檢驗比較各聯(lián)合用藥組與對應(yīng)的單獨用藥組之間凋亡率表達水平差異顯著性。
　　 3.Westernblot法從蛋白水平，RT-PCR和qRT-PCR從基因水平進行氟西汀作用的機制研究
　　 各藥物處理組（同上）作用兩細胞72h后，提取總蛋白用免疫蛋白印跡（Westernblot）方法從分子水平檢測凋亡相關(guān)蛋白p53、Bcl-2蛋白，多藥耐藥蛋白P-gp

12、、GST-π的表達情況。多藥耐藥基因MDR1mRNA的表達檢測則是兩細胞經(jīng)各組藥物處理48h后，提取細胞總RNA進行半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和實時定量PCR(quantitativerealtimePCR，qRT-PCR)實驗。對所有組的目的蛋白及mRNA表達量以內(nèi)參表達量進行上樣量標準化后，以control組作為對照進行歸一，采用one-wayANOVA統(tǒng)計方法，并根據(jù)方差齊性與否采用Dun

13、nett或可信區(qū)間檢驗法比較各單獨用藥組蛋白和mRNA表達與空白組水平差異顯著性，以及t檢驗比較各聯(lián)合用藥組與對應(yīng)的單獨用藥組之間蛋白和mRNA表達水平差異顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT實驗檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細胞活力的影響
　　 MTT實驗結(jié)果表明氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7細胞的IC50值分別是25.34±1.3μg/ml和17.56±0.98μg/ml，5μg/ml濃度下MCF-7

14、/ADM和MCF-7細胞的增值抑制率分別是5.43±2.33％和7.53±0.98％，因此選擇5μg/ml作為氟西汀無細胞毒性的聯(lián)合用藥濃度。
　　 阿霉素聯(lián)合氟西汀作用MCF-7/ADM細胞前后IC50值分別是13.62±1.44μg/ml，2.71±0.42μg/ml(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計學意義。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RF為5.03。阿霉素聯(lián)合氟西汀作用MCF-7細胞前后IC50值分別是0.53±0.12μg/ml和0.45±0.

15、04μg/ml，無顯著性差異(P=0.338)。阿霉素單獨作用耐藥株和敏感株的IC50值相差25.7倍(P＜0.001)。
　　 MCF-7/ADM細胞中紫杉醇聯(lián)合用藥前后的IC50分別是3.30±0.12μg/ml和2.59±0.11μg/ml(P=0.002)。而MCF-7細胞中分別是2.11±0.37μg/ml和1.22±0.16μg/ml(P=0.019)，差異均具統(tǒng)計學意義。紫杉醇單獨作用耐藥株和敏感株的IC50值統(tǒng)計

16、結(jié)果具有顯著性差異(P=0.006)。
　　 2.氟西汀增強阿霉素、紫杉醇凋亡誘導作用
　　 流式細胞儀檢測經(jīng)藥物處理24h后的細胞凋亡結(jié)果顯示:MCF-7/ADM細胞中各組間凋亡率有顯著性差異(F=312.564，P＜0.001)。多重比較顯示與空白組相比，F(xiàn)LX(P=0.161)、ADM(l)(P=0.061)、FLX-ADM(l)(P=0.058)三組凋亡率無顯著差異;其余各組凋亡率均顯著提高(P＜0.05)，凋亡

17、率的提高呈劑量依賴性。t-檢驗聯(lián)合氟西汀前后各組凋亡率差異結(jié)果顯示:與單獨用藥相比，聯(lián)合用藥各組凋亡率均有所上升，差異有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)LX-PTX(l)組(P=0.001)、FLX-PTX(h)組(P=0.000)、FLX-ADM(l)組(P=0.020)、FXL-ADM(h)組(P=0.025)。
　　 MCF-7細胞中各組間凋亡率具有顯著性差異(F=1095.432，P＜0.001):多重比較顯示與空白組相比，除氟西汀單獨用

18、藥組外，其他各處理組凋亡率均顯著提高（均P＜0.05）。聯(lián)合氟西汀前后各組凋亡率差異顯示:FLX-PTX(l)組(P=0.002)、FLX-ADM(l)組(P=0.008)、FLX-PTX(h)組(P=0.007)、FLX-ADM(h)組(P=0.020)與其對應(yīng)的單獨用藥組相比凋亡率均有提高。
　　 3.Westernblot檢測兩細胞中p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白表達
　　 3.1.兩細胞中p53蛋白

19、表達
　　 MCF-7/ADM細胞中，One-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析顯示組間蛋白表達具有顯著性差異(F=792.490，P＜0.001)，與空白組相比，除氟西汀單獨作用組外(P=0.953)，其余各藥物處理組p53蛋白表達均有上升，且呈劑量依賴性(均P＜0.001)。與阿霉素、紫杉醇單獨作用相比，氟西汀聯(lián)合用藥顯著上調(diào)p53的表達水平，各組均具統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 MCF-7細胞中，One-way

20、ANOVA分析各組p53表達具有顯著性差異(F=272.446，P＜0.001)。與空白組相比，各藥物處理組p53蛋白表達均顯著上升，且呈劑量依賴性。與耐藥株相似，與對應(yīng)的單獨作用相比，聯(lián)合氟西汀后顯著上調(diào)p53的表達水平，且上調(diào)效果更為明顯。與阿霉素、紫杉醇高濃度單獨用藥相比，分別8倍和14倍的上調(diào)p53水平（均P＜0.05）。
　　 3.2.兩細胞中Bcl-2蛋白表達
　　 MCF-7/ADM細胞十個藥物處理組間Bc

21、l-2蛋白表達統(tǒng)計有顯著性差異(F=57.169，P＜0.001)。與空白組相比，氟西汀單獨作用Bcl-2蛋白表達無統(tǒng)計學差異。阿霉素、紫杉醇單獨作用MCF-7/ADM細胞并沒有出現(xiàn)預期的下調(diào)Bcl-2表達，反而有所上調(diào)，這種現(xiàn)象紫杉醇低高兩組尤為突出，蛋白表達的上升均具統(tǒng)計學意義。但氟西汀逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，使得各聯(lián)合用藥組Bcl-2相對表達水平均下降到空白組以下，差異均具統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 MCF-7細胞各藥物

22、處理組間Bcl-2蛋白表達有統(tǒng)計學差異(F=569.921，P＜0.001)。該細胞株中空白組仍檢測到Bcl-2蛋白的表達，氟西汀單獨作用對其無影響。與MCF-7/ADM細胞不同的是，紫杉醇單獨作用MCF-7細胞兩組下調(diào)Bcl-2的表達至空白組的77％和38.8％，阿霉素引起的下調(diào)較小，分別至空白組的85.6％和72.3％。聯(lián)合氟西汀后，Bcl-2的下調(diào)更為顯著，阿霉素和紫杉醇的聯(lián)合用藥組相對表達量均分別降到空白組的60％和30％以下，

23、差異有顯著性(均P＜0.05);與其單獨用藥組相比，差異有顯著性，（均P＜0.05）。
　　 3.3.兩細胞中P-gp蛋白表達
　　 MCF-7/ADM細胞中，各藥物處理組間P-gp的表達具統(tǒng)計學差異(F=96.914，P＜0.001)。可信區(qū)間檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，無論單用阿霉素還是阿霉素聯(lián)合應(yīng)用氟西汀，P-gp表達均無顯著性變化。而紫杉醇單獨作用使P-gp水平高達空白組的3.6倍，但聯(lián)合氟西汀后卻下調(diào)至空白組的3

24、0％以下。
　　 MCF-7細胞中各藥物處理組間P-gp的表達也具統(tǒng)計學差異(F=146.396，P＜0.001)。與空白組相比，阿霉素單用或聯(lián)合應(yīng)用組蛋白表達情況與MCF-7/ADM細胞相似;紫杉醇聯(lián)合氟西汀組與其單獨作用組相比雖蛋白表達下調(diào)有統(tǒng)計學差異，但相對空白組的表達量差異不大。
　　 3.4.兩細胞中GST-π蛋白表達
　　 MCF-7/ADM細胞空白組檢測到GST-π的表達，氟西汀單獨作用對其表達無影

25、響(P＞0.05);其余各藥物處理組均引起GST-π的表達下調(diào)（均P＜0.05），而與對應(yīng)的單獨用藥相比，氟西汀聯(lián)合用藥組GST-π表達水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。MCF-7細胞各組均未檢測到GST-π的表達。
　　 4.兩細胞中MDR1基因表達
　　 經(jīng)one-wayANOVA統(tǒng)計分析，MCF-7/ADM各藥物處理組間差異有顯著性(F=9.404，P＜0.01)，經(jīng)可信區(qū)間檢驗顯示與空白組相比，除F

26、LX組外各單獨用藥組MDR1表達均呈上調(diào)態(tài)勢，差異有統(tǒng)計學意義。氟西汀聯(lián)合紫杉醇誘導MDR1基因表達的下調(diào)，與其對應(yīng)單獨用藥相比差異有顯著性(P=0.005，P＜0.001)，但與Westernblot結(jié)果不同的是，氟西汀聯(lián)合阿霉素反而引起MDR1基因表達上調(diào)，F(xiàn)LX-ADM(l)組上調(diào)明顯，差異具統(tǒng)計學意義(P=0.030)。MCF-7細胞中未檢測到MDR1基因的表達。
　　 qRT-PCR結(jié)果同樣證實了這一點:以MCF-7細

27、胞的control組為參比，MCF-7/ADM細胞中MDR1相對表達量是其的200倍以上，由此可見MCF-7細胞中MDR1表達可忽略。而MCF-7/ADM細胞中MDR1的相對表達量呈上升趨勢，F(xiàn)LX-ADM(l)相對表達量是ADM(l)組的2倍，control組的近5倍，差異均具統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.無細胞毒性水平的氟西汀與阿霉素、紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7/ADM和MCF-7細胞增殖抑