鹽酸氯丙嗪促進藥物直腸吸收機制研究.pdf

1、鹽酸氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrocloride，N，N-二甲基-2-氯-IOH-吩噻嗪-10-丙胺鹽酸鹽)為吩噻嗪類抗精神病藥。Fix等報道與靜脈注射給藥相比，吩噻嗪類藥物可顯著提高硫酸慶大霉素與頭孢噻吩鈉的直腸吸收相對生物利用度；本課題組在前期研究中也觀察到鹽酸氯丙嗪能夠較大程度地提高安乃近經(jīng)兔直腸吸收的速度與程度且具有濃度依賴性。這些結果表明鹽酸氯丙嗪有可能是一種新型的藥物直腸吸收促進劑，但其促吸收機理仍未見報道

2、。 本研究以Caco-2細胞單層模型為藥物轉運吸收的體外模型，選擇脂溶性小(logKow=0.38)且直腸吸收效果欠佳的氨基比林為被促進模型藥，通過對鹽酸氯丙嗪促吸收作用的具體特征的研究，考察不同濃度鹽酸氯丙嗪對Caco-2細胞膜結構與流動性的影響，以及應用免疫熒光法和Western blot法考察Caco-2細胞單層膜中緊密連接蛋白ZO-1分布與表達的變化情況，為闡明鹽酸氯丙嗪作為直腸吸收促進劑的可能機理提供依據(jù)。 構

3、建了完整性良好的Caco-2細胞單層模型，即Caco-2細胞經(jīng)21-24天培養(yǎng)，形態(tài)學上融合形成連續(xù)、完整的致密細胞單層，其AP側覆蓋一層刷狀緣微絨毛，此時TEER>200Ω·cm2，熒光黃的Papp<1.0×10-6cm/s，即表明單層膜非常致密且具有良好完整性，可以用于藥物轉運研究。 建立HPLC-MS/MS法作為鹽酸氯丙嗪和氨基比林同步定量方法：鹽酸氯丙嗪在0.005~0.32mg/l范圍內具有良好的線性關系，平均回收率為

4、92.1％~114.68％，日內與日間相對標準偏差(RSD)均未大于8％；氨基比林在0.005～0.32mg/l范圍內具有良好的線性關系，平均回收率為97％~107.16％，日內與日間相對標準偏差(RSD)均未大于8％，說明本方法專屬性強、重現(xiàn)性好、精密度和回收率均較高，可作為轉運研究的生物樣品測定方法。 MTT法以90％以上的Caco-2細胞存活率確定轉運試驗的藥物濃度：鹽酸氯丙嗪低、中、高濃度為2.5、10、40mg/l和

5、氨基比林低、高濃度為10、40mg/l。鹽酸氯丙嗪與氨基比林按分組設計以不同濃度加至Caco-2細胞單層膜的AP側，于不同時間在BL側取樣，用HPLC-MS/MS法測定各樣品濃度，采用內標法進行定量。轉運試驗結果顯示，氨基比林在Caco-2細胞單層膜中的累計轉運量Q與時間t呈線性正相關，且轉運速率常數(shù)J隨鹽酸氯丙嗪C0增加而增大；由AP-BL轉運Papp-時間曲線可見，氨基比林Papp值隨時間延長而降低，且同時給藥的鹽酸氯丙嗪CO越大，

6、則同一時間點氨基比林Papp越大，即鹽酸氯丙嗪Co越大且作用時間越長則其促轉運作用越顯著。而10mg/l組和40mg/l組氨基比林在分別加入10mg/l或40mg/l鹽酸氯丙嗪后，AP-BL方向120min時Papp均顯著增大約為原值的2倍(p<0.05)，即濃度高于2.5mg/l的鹽酸氯丙嗪能顯著增加氨基比林在Caco-2細胞單層模型中的轉運。由此可見，鹽酸氯丙嗪可促進氨基比林在Caco-2細胞單層膜中AP-BL轉運，此促轉運作用具有

7、濃度與時間依賴性。 氨基比林空白對照組(A，B)組間比較顯示，同一時間點氨基比林AP-BL轉運Papp隨氨基比林初濃度的增加而減小，說明氨基比林的跨膜轉運可能具有飽和現(xiàn)象，即與某載體相關，但該結果并無顯著性差異(p>0.05)，表明其轉運方式仍以被動轉運為主。單獨給藥的鹽酸氯丙嗪Papp-時間曲線也隨時間延長而降低，但各組(C，D，E)在給藥后45 min內均出現(xiàn)了程度不一的小峰，而其轉運120min時AP-BL方向Papp卻未

8、隨Co增大而減小，反而呈現(xiàn)增加趨勢，且組間比較顯示40mg/l組鹽酸氯丙嗪(E)與2.5mg/l組(C)的Papp存在顯著差異(p<0.05)，認為鹽酸氯丙嗪轉運方式以被動為主，因而可觀察到Papp-時間曲線逐漸降低；小峰以及C，E組間顯著性差異可能與其促轉運機理或某一載體相關，由于具有結構兩親性的鹽酸氯丙嗪很可能與Caco-2細胞膜上某一相關結構或蛋白位點等相互作用，例如破壞膜結構或是打開旁路轉運系統(tǒng)的緊密連接而使自身跨膜通量增大；也

9、可能是與某一載體蛋白結合而出現(xiàn)組間差異。 采用Bradford法測定不同濃度鹽酸氯丙嗪作用Caco-2細胞后其上清液吸光度值，計算細胞膜破壞百分率以及電鏡觀察細胞膜形態(tài)學變化；同時應用DPH(1，6-diphenyl-1，3，5-hexatriene)熒光探針法測定細胞膜脂質DPH的熒光強度并計算熒光偏振度Pr，結果顯示：鹽酸氯丙嗪顯著影響Caco-2細胞的穩(wěn)定，不同的濃度對Caco-2細胞的影響程度不同。低濃度(<40mg/l

10、)的鹽酸氯丙()可明顯增加Caco-2細胞膜流動性，且隨作用時間的延長而增加；高濃度情況下鹽酸氯丙嗪(>50mg/l)則對Caco-2細胞膜造成了不完全性破壞，使細胞膜在形態(tài)上出現(xiàn)不平整及致孔性破裂。Caco-2細胞的膜完整性水平隨鹽酸氯丙嗪作用濃度的增加而降低。 應用免疫熒光法和Western blot法，以兔抗ZO-1抗體為第一抗體，研究各濃度鹽酸氯丙嗪處理后的Caco-2細胞單層膜中ZO-1分布與表達變化。從激光掃描共聚焦

11、顯微鏡觀察到，空白對照組中ZO-1在細胞緊密連接區(qū)域邊界清晰、分布均勻且熒光表達強度高；隨鹽酸氯丙嗪濃度增大，ZO-1蛋白的分布發(fā)生變化，不連續(xù)區(qū)域逐漸增多、面積增大，多數(shù)區(qū)域的熒光表達強度變弱。進一步的Western Blot結果可見，鹽酸氯丙嗪濃度大于10mg/l時ZO-1蛋白表達的積分光密度值(IOD)與空白對照組IOD值有顯著性差異(p<0.05)，隨鹽酸氯丙嗪濃度的增大IOD值降低，即鹽酸氯丙嗪可降低ZO-1蛋白表達，此作用具

12、有濃度依賴性。 綜上所述，鹽酸氯丙嗪能夠增大氨基比林在Caco-2細胞單層模型中的轉運，且此促轉運能力具有濃度和時間依賴性，即隨濃度的增高與時間的延長，鹽酸氯丙嗪促進藥物轉運的作用由低濃度(<40mg/l)增大膜的流動性向高濃度(>50mg/l)通過致孔作用破壞膜的完整性轉變；其原因與鹽酸氯丙嗪分子結構有關，因其分子中含有親脂性的三環(huán)硫氮雜葸母核與親水性的末端丙胺基團，這種特殊的結構兩親性使它能夠與直腸粘膜上皮細胞相互作用，進而