Mitofusin2基因?qū)Υ笫笱芷交〖毎鸄7r5凋亡作用的研究.pdf

1、目的：研究外源性線粒體融合蛋白2基因(Mitofusin2,Mfn2)對大鼠主動脈平滑肌細胞A7r5凋亡的影響，并對其可能的分子機制進行探討。
　　方法：將重組質(zhì)粒pEGFP-mfn2在陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導下體外轉(zhuǎn)染A7r5細胞,將細胞分為三組：空白對照組（control組，未轉(zhuǎn)染）、空載體對照組（pEGFP–N1組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）和實驗組（pEGFP–mfn2組，轉(zhuǎn)染pEGFP–mfn2）。轉(zhuǎn)染后，

2、用流式細胞儀（FCM）測定轉(zhuǎn)染效率。分別于轉(zhuǎn)染后48h收獲三組細胞，采用Western blot檢測 Mfn2的表達。采用Hoechst染色激光共聚焦顯微鏡、Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀及一步TUNEL細胞凋亡檢測法觀察Mfn2對A7r5凋亡的影響并計算凋亡率。Western Blot方法檢測三組細胞中凋亡相關(guān)因子Bcl-xl、Bax、Caspase-9以及磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化Bad( p-Bad)的

3、表達。采用方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
　　結(jié)果：以流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率，pEGFP–N1組和pEGFP–mfn2組于轉(zhuǎn)染48h轉(zhuǎn)染效率達到最高，分別為（63.3±2.4）％和（65.2±3.5）％，兩組比較差異無顯著性（P＞0.05）。Western blot檢測顯示，pEGFP–mfn2組Mfn2蛋白表達水平增高,其半定量結(jié)果為（1.084±0.057），control組和pEGFP–N1組mfn2蛋白表達半定量分別為（0

4、.534±0.075）、（0.552±0.034），pEGFP–mfn2組與兩對照組比較差異均有顯著性（均P<0.05）。Hoechst染色激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染后48h，pEGFP–mfn2組細胞凋亡率為（13.37±2.85）％，與control組（0.92±0.05）％和pEGFP–N1組（1.33±0.06）％相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染4

5、8h及72h，pEGFP–mfn2組細胞凋亡率分別為（15.74±2.42）％、（32.23±3.91）％，空白對照組和空載體對照組細胞均未發(fā)生明顯凋亡，前者與后二者比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。轉(zhuǎn)染72h一步TUNEL法熒光顯微鏡觀察，實驗組可見標記紅色熒光的凋亡細胞，其陽性細胞數(shù)為（21.3±2.8）％，兩對照組未見明顯標記紅色熒光的晚期凋亡細胞。轉(zhuǎn)染后48h經(jīng) Western blot檢測顯示：Bax蛋白的半定量結(jié)果

6、pEGFP–mfn2組為（0.879±0.126），與 control組（0.545±0.069）和pEGFP–N1組（0.498±0.074）比較均有統(tǒng)計學差異（均P<0.05）；Bcl-xl蛋白的半定量結(jié)果pEGFP–mfn2組為（0.527±0.061），與control組（0.992±0.107）和pEGFP–N1組（1.011±0.093）比較均有統(tǒng)計學差異（均P<0.05）；pEGFP-mfn2組Caspase-9蛋白表達半

7、定量結(jié)果為(0.398±0.047)，control組和pEGFP-N1組未見表達；pEGFP–mfn2組p-Akt蛋白表達量（0.572±0.085）低于control組（0.943±0.109）和pEGFP–N1組（0.935±0.072），其差異有顯著性（均P<0.05）；pEGFP–mfn2組p-Bad的表達量（0.411±0.046）較control組（0.787±0.125）和pEGFP–N1組（0.831±0.114）低，