磁珠結(jié)合質(zhì)譜分析2型糖尿病腎病早期尿液多肽及藥物干預(yù)研究.pdf

1、糖尿病腎病(DiabeticNephropathy，DN)是2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)患者常見(jiàn)的、嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的慢性并發(fā)癥，發(fā)病率逐年升高，據(jù)估測(cè)[1]，2030年全世界T2DM患者數(shù)量將從2000年的1.71億增加到3.66億，其中30％-40％的T2DM將發(fā)展為DN，在歐美國(guó)家DN是終未期腎病(End-stagerenaldisease，ESRD)的最常見(jiàn)病因[2]，約占全部ESRD病例的

2、44％。早期診斷DN并干預(yù)其發(fā)展越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視，但DN起病隱襲，早期缺乏明顯的臨床癥狀。目前臨床上早期診斷DN存在較大困難。腎活檢是早期診斷最可靠的方法，然而，很多患者不愿意接受這種具有創(chuàng)傷性的侵入檢查，很多接受檢查的患者腎臟組織病理活檢并不能找到特征性的病理改變[3]。腎穿刺活檢術(shù)不能作為T(mén)2DM患者檢查的常規(guī)項(xiàng)目。而尿液富含腎臟病變信息，取材簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)傷，可重復(fù)取樣，目前被廣泛認(rèn)可的糖尿病腎病的早期實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)是持續(xù)性微量

3、白蛋白尿，已有許多研究發(fā)現(xiàn)尿微量白蛋白(Microalbuminuria，MALB)作為DN早期診斷指標(biāo)的準(zhǔn)確性和特異性不高，2型糖尿病患者大多年齡較大，常伴有高血壓、冠心病等合并癥，微量白蛋白尿也可因這些并發(fā)癥引起[4]。且在MALB出現(xiàn)時(shí)，DN已發(fā)展到第Ⅲ期，因而只依靠監(jiān)測(cè)MALB并不能及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)DN做出診斷，會(huì)帶來(lái)較高的誤診和漏診。因此2型糖尿病腎病的早期診斷迫切需要尋找新的特異性標(biāo)志物以判斷病情，指導(dǎo)治療，評(píng)價(jià)療效。隨著蛋白質(zhì)

4、組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將其與體液技術(shù)相結(jié)合的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為DN早期診斷標(biāo)志物的篩選提供了技術(shù)支持，利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可能發(fā)現(xiàn)一些新的DN早期診斷標(biāo)志物并作為藥物療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)。本研究通過(guò)弱陽(yáng)離子(weakcationexchange，WCX)磁珠分離系統(tǒng)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-flightMassSpectrometry

5、，MALDI-TOF-MS)技術(shù)對(duì)2型糖尿病患者及模型動(dòng)物的尿液標(biāo)本進(jìn)行比較蛋白組學(xué)分析，并對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)研究。本課題研究?jī)?nèi)容共分為以下三部分。
　　 第一部分:2型糖尿病腎病患者尿小分子多肽差異分析;
　　 第二部分:2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及腎病早期尿小分子多肽差異分析;
　　 第三部分:厄貝沙坦干預(yù)對(duì)糖尿病腎病大鼠尿小分子多肽影響。
　　 第一部分:2型糖尿病腎病患者尿小分子多肽差異分析

6、r>　　 目的:利用弱陽(yáng)離子磁珠分離系統(tǒng)結(jié)合MALDI-TOF-MS的方法獲取糖尿病腎病患者的尿小分子多肽譜。
　　 方法:按Mogensen標(biāo)準(zhǔn)，68例2型糖尿病患者經(jīng)測(cè)三天平均微量白蛋白尿排泄率(UrinaryAlbaminExcretionRate，UAER)后分組，其中正常蛋白尿(A)組24例，微量白蛋白(B)組22例，大量蛋白(C)組22例;健康對(duì)照(D)組20例。A及B組腎小球率過(guò)濾(glomerularfiltr

7、ationrate，GFR)均＞90ml/(min·1.73m2)，C組GFR60～89ml/(min·(1).73m2)。采用WCX磁珠純化試劑盒富集尿多肽，再經(jīng)MALDI-TOF-MS技術(shù)，采集尿液多肽譜，應(yīng)用ClinProtTM軟件進(jìn)行生物學(xué)比較分析。
　　 結(jié)果:質(zhì)荷比＜12000時(shí)，A組與D組相比，有15個(gè)蛋白質(zhì)峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B組與D組相比，有1個(gè)蛋白質(zhì)峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0298）。C組

8、與D組相比，有10個(gè)蛋白質(zhì)峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:弱陽(yáng)離子磁珠分離系統(tǒng)聯(lián)合MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，能夠獲得健康人及DN患者尿液小分子多肽譜，為進(jìn)一步從中尋找早期篩查及評(píng)價(jià)干預(yù)效果的標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。
　　 第二部分:2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及腎病早期尿小分子多肽差異分析
　　 目的:探尋高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導(dǎo)致2型糖尿病

9、大鼠糖尿病腎病早期尿液小分子差異多肽。
　　 方法:①40只4周齡SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型(A)組30只和對(duì)照(B)組10只，A組應(yīng)用高糖高脂飲食6周聯(lián)合STZ注射（以注射時(shí)計(jì)為0），誘導(dǎo)致2型糖尿病大鼠模型，B組正常飲食;②每2周測(cè)體質(zhì)量，尾靜脈取血檢測(cè)血糖;-2、2、12周周末收集各組大鼠24小時(shí)尿液、血樣本和腎臟標(biāo)本。尿液測(cè)24小時(shí)白蛋白排泄率，血樣本測(cè)胰島素、膽固醇、甘油三脂等指標(biāo)，腎臟

10、標(biāo)本HE染色光鏡下觀(guān)察。③將大鼠尿液分為四組:A1組（-2周末時(shí)A組尿液，10個(gè)標(biāo)本）、A2組（12周末時(shí)A組尿液，10個(gè)標(biāo)本）;B組（12周末時(shí)B組尿液，10個(gè)標(biāo)本）。采用弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)各組尿液樣本進(jìn)行尿液多肽譜的采集，應(yīng)用ClinProTools軟件進(jìn)行生物學(xué)比較分析。
　　 結(jié)果:①高糖高脂飲食6周聯(lián)合25mg/kgSTZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病腎病大鼠模型，成模率87％，成模大鼠具有高血糖、

11、高血脂、胰島素抵抗等特點(diǎn)，并出現(xiàn)DN相應(yīng)的形態(tài)及功能改變。②弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)三組尿液。ClinProTools軟件分析后發(fā)現(xiàn)A1和B組間無(wú)明顯差異。A2組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有7個(gè)差異多肽峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在A2組表達(dá)高表達(dá)有4個(gè)，低表達(dá)的有3個(gè)。
　　 結(jié)論:①利用高糖高脂飲食6周聯(lián)合小劑量STZ可以成功誘導(dǎo)2型糖尿病腎病大鼠模型。②弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，能獲得2型糖尿

12、病大鼠糖尿病腎病早期和正常對(duì)照大鼠尿液多肽譜，并有效地鑒定出峰度較高的差異峰。
　　 第三部分:厄貝沙坦干預(yù)對(duì)糖尿病腎病大鼠尿小分子多肽影響
　　 目的：探討血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)1型受體拮抗劑(Angiotensinreceptorblocker，ARB)厄貝沙坦對(duì)2型糖尿病大鼠尿小分子多肽的影響。
　　 方法：①將30只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（A組）、糖尿病組（B組）、厄貝沙坦

13、治療組（C組）。高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)致2型糖尿病大鼠糖尿病腎病早期，以STZ注射時(shí)計(jì)為0;②C組在造模成功后3天即開(kāi)始喂服厄貝沙坦[50mg/(kg·d)，杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司）]，B組則以等體積蒸餾水灌胃。每2周末測(cè)體質(zhì)量、血壓，尾靜脈取血檢測(cè)血糖;-2、12周末收集各組大鼠24小時(shí)尿液、血樣本和腎臟標(biāo)本。尿液測(cè)24小時(shí)白蛋白排泄率，血樣本測(cè)胰島素、膽固醇、甘油三脂等指標(biāo)。腎臟標(biāo)本測(cè)腎重后制作病理切片。③將大鼠

14、尿液分為四組:A1組（-2周時(shí)A組尿液，8個(gè)標(biāo)本）、A2組(12周時(shí)A組尿液，8個(gè)標(biāo)本)、B組（12周時(shí)B組尿液，8個(gè)標(biāo)本）和C組（12周時(shí)C組尿液，8個(gè)標(biāo)本）。采用弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)各組尿液樣本進(jìn)行尿液多肽譜的采集，應(yīng)用ClinProTools軟件進(jìn)行生物學(xué)比較分析。
　　 結(jié)果:①弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)四組尿液。ClinProTools軟件分析后發(fā)現(xiàn)A1和A2組間無(wú)明顯差

15、異。A2組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有7個(gè)差異多肽峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在B組表達(dá)高表達(dá)有4個(gè)，低表達(dá)的有3個(gè)。C組和A2組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有5個(gè)差異多肽峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在C組表達(dá)高表達(dá)有3個(gè)，低表達(dá)的有2個(gè)。C組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有2個(gè)差異多肽峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在C組表達(dá)高表達(dá)有1個(gè)，低表達(dá)的有1個(gè)。②C組12周時(shí)腎臟病理結(jié)構(gòu)與同時(shí)期B組比較改變輕微。
　　 結(jié)論:①弱陽(yáng)離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，能獲得2型糖尿病