雞傳染性支氣管炎病毒感染HeLa細(xì)胞的研究及其天然受體的鑒定.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種高度接觸性的病毒性傳染病。主要引起雞的呼吸系統(tǒng)疾病、腎炎并伴隨產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的下降。IBV 屬于冠狀病毒科，為單股正鏈RNA病毒。大部分冠狀病毒具有宿主特異性和組織嗜性，只能侵染天然宿主和一些親緣關(guān)系極其相近的宿主。以前的研究認(rèn)為IBV只能感染雞，但近兩年相繼在其他一些雞形目的動物體內(nèi)分離到IBV樣病毒，如孔雀、幾內(nèi)亞雞和鷓鴣等，這些分離的毒株在基因結(jié)構(gòu)上與IBV很相似

2、，基因序列的同源性甚至達(dá)到99％以上；而在非雞形目動物如鴨、鴿子和灰雀等的體內(nèi)分離到的病毒，通過基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，雖然它們在氨基酸同源性上與IBV存在一定的差異，但依然屬于第3群冠狀病毒的范疇。 IBV這種從感染單一宿主延伸到更多的其他動物的現(xiàn)象，讓人聯(lián)想到2002年爆發(fā)的“嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥”(SARS)，它的病原是一種新的冠狀病毒(嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒， SARS-CoV)，而在多種動物體內(nèi)分離到的SARS-

3、CoV樣冠狀病毒說明SARS-CoV極有可能最初起源于動物。因此，研究動物冠狀病毒與SARS-CoV的關(guān)系及冠狀病毒跨越物種屏障的機(jī)制很有必要。 基于此，本研究以IBV為模式病毒，將其跨種感染人源細(xì)胞 HeLa，探討動物冠狀病毒跨種感染的機(jī)制，同時(shí)對IBV跨種感染過程中起到關(guān)鍵作用的因子進(jìn)行了研究，另外也鑒定了IBV的天然受體。主要研究內(nèi)容如下： 1、不同IBV毒株跨種感染HeLa細(xì)胞的研究7個(gè)不同的IBV毒株，包括M4

4、1、H52、H120、Gray、Holte、Connecticut和M52-19(Beaudette52-19)，分別接種單層和剛剛消化的 HeLa 細(xì)胞。結(jié)果顯示這些毒株均不能在單層的HeLa細(xì)胞上增殖；而M41、H52、H120和Gray可以在剛剛新鮮消化的HeLa細(xì)胞上增殖，并會導(dǎo)致HeLa細(xì)胞發(fā)生明顯的病變，剩余的3個(gè)毒株Holte、Connecticut和M52-19卻不能。通過觀察是否產(chǎn)生細(xì)胞病變及中和實(shí)驗(yàn)、S1基因的RT-

5、PCR擴(kuò)增、血凝及血凝抑制、病毒N蛋白的Western blotting檢測等方面來證實(shí)感染的真實(shí)性。 2、S1基因的變異在IBV跨種感染過程中的作用M41毒株在新鮮消化的HeLa細(xì)胞上持續(xù)傳26代，RT-PCR擴(kuò)增第1代、第5代和第21代病毒的S1基因，結(jié)果顯示第1代跟第5代S1基因的序列完全一致，而第21代與第1代相比也僅僅只有一個(gè)堿基(A728G)的改變，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的變異。然而這唯一的一個(gè)點(diǎn)突變對 IBV的跨種感染似乎

6、沒有決定性的作用。 3、病毒血凝價(jià)的改變與跨種感染的關(guān)系據(jù)報(bào)道IBV經(jīng)胰酶或磷酸脂酶C處理后可以凝集0.5％的新鮮制備的雞紅細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)在上述7個(gè)IBV的毒株中，M41、H52、H120和Gray經(jīng)磷酸脂酶處理后可以凝集雞紅細(xì)胞，而另外3個(gè)毒株Holte、Connecticut和M52-29則不能凝集；另一方面，M41在HeLa細(xì)胞上持續(xù)傳代會導(dǎo)致M41的血凝價(jià)逐漸下降；但這些傳代的細(xì)胞毒(低或無血凝性)接種雞胚后，尿囊液中

7、的病毒會重新獲得較高的血凝價(jià)?？梢娋哂醒缘腎BV毒株更易于適應(yīng)異源細(xì)胞。 4、唾液酸糖蛋白(脂)在IBV跨種感染過程中的作用某些冠狀病毒可以利用細(xì)胞表面的唾液酸糖蛋白(脂)作為進(jìn)入細(xì)胞的受體，而神經(jīng)氨酸酶(NA)可以降解細(xì)胞表面的唾液酸糖蛋白(脂)，這樣就會降低病毒感染的幾率。根據(jù)這一原理，將 IBV 感染經(jīng) NA 處理和未處理的 HeLa 細(xì)胞，對比發(fā)現(xiàn)IBV在NA處理過的HeLa細(xì)胞的感染滴度明顯降低，說明唾液酸糖蛋白(

8、脂)在IBV感染 HeLa 細(xì)胞的過程中起到重要的作用。 5、氨基肽酶N、胰酶和EDAT對IBV跨種感染的作用氨基肽酶(APN)是很多冠狀病毒的受體，通過封閉細(xì)胞表面APN的受體功能可以達(dá)到阻斷病毒感染細(xì)胞的目的。用鼠抗人氨基肽酶(hAPN)的單克隆抗體(WM15)封閉 HeLa 細(xì)胞表面的氨基肽酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種封閉并沒有阻斷 IBV 感染HeLa細(xì)胞，這說明hAPN不是IBV感染 HeLa 細(xì)胞的途徑。 以前的研

9、究證實(shí)胰酶可以提高某些病毒的滴度。先確定胰酶的安全濃度，然后在IBV接種后將此安全濃度胰酶添加到的細(xì)胞培養(yǎng)液里，結(jié)果顯示添加了胰酶的IBV的感染力與單獨(dú)使用IBV是一樣的；另外，IBV對經(jīng)EDTA消化HeLa細(xì)胞與經(jīng)胰酶消化的HeLa細(xì)胞的感染滴度是相同的。這說明胰酶、EDTA不是 IBV 跨種感染所必需的。 6、鑒定IBV的天然受體研究證實(shí)IBV的一個(gè)毒株(Ark99)可以利用貓的氨基肽酶(fAPN)作為細(xì)胞受體。本研究通過克

10、隆雞的APN(gAPN)，探討gAPN作為IBV天然受體的可能性。 RT-PCR擴(kuò)增到全長的gAPN基因，分別在原核和真核表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)。將原核表達(dá)的gAPN蛋白進(jìn)行的ELISA及Western blotting試驗(yàn)證實(shí)原核表達(dá)的gAPN蛋白在體外可以與IBV結(jié)合，而且這種結(jié)合可以被針對gAPN的抗體阻斷。 將gAPN轉(zhuǎn)染 IBV的非敏感細(xì)胞(PK-15、HeLa)，構(gòu)建真核表達(dá)體系。通過間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、半