基于栽培辣椒和野生辣椒的全基因組測(cè)序揭示辣椒屬的馴化與特異性.pdf

1、為了深入研究辣椒的特異性和馴化，本研究開展辣椒的全基因組測(cè)序。測(cè)序的辣椒材料為遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的一年生辣椒‘遵辣1號(hào)’及其來自墨西哥的野生材料‘Chiltepin’，并對(duì)其他18個(gè)辣椒栽培材料和2個(gè)野生/半野生辣椒材料進(jìn)行了重測(cè)序。通過辣椒基因組、轉(zhuǎn)錄組、群體多樣性、小RNA和次級(jí)代謝產(chǎn)物等方面的研究，得到如下結(jié)果:
　　1.完成辣椒全基因組測(cè)序，獲得兩個(gè)辣椒材料基因組的精細(xì)序列圖譜
　　對(duì)一年生辣椒‘遵辣1號(hào)’和其

2、野生材料“Chikepin”分別進(jìn)行了146.43x（全基因組覆蓋率，下同）和96.37x的全基因組測(cè)序，最后分別獲得99.78x和66.73x的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。通過復(fù)雜的生物信息學(xué)分析和測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝，兩個(gè)辣椒材料基因組的組裝大小分別為3.35 Gb和3.48 Gb?！窭?號(hào)’的scaffold N50和contig N50分別為1.22 Mb和55.43kb;‘Chiltepin’的scaffold N50和contig N50分

3、別為445.59 kb和52.23kb。通過高密度遺傳圖譜的協(xié)助組裝，獲得均超過80％測(cè)序數(shù)據(jù)都錨定到相應(yīng)染色體上的2個(gè)精細(xì)序列圖譜。
　　2個(gè)基因組的完整序列和基因組注釋信息公布在自建的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站上(release2.0，http://peppersequence.genomics.cn)，供全球辣椒研究者或者相關(guān)研究者參考。
　　2.重復(fù)序列和基因組的擴(kuò)張
　　本研究采用同源搜索和從頭預(yù)測(cè)相結(jié)合的方法鑒定

4、‘遵辣1號(hào)’和‘Chiltepin’基因組中的轉(zhuǎn)座元件，檢測(cè)到Ⅰ型和Ⅱ型轉(zhuǎn)座子，前者有LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（主要包括copia類和gypsy類）、長(zhǎng)散在核重復(fù)序列(long interspersed nuclear elements，LINE)類、短散在核重復(fù)序列(Short interspersed nuclear elements，SINE)類等，后者有hat、En-Spam、Mudra及相關(guān)的序列等。
　　上述轉(zhuǎn)座元件的分析表

5、明，不同類型的轉(zhuǎn)座元件占辣椒基因組大小的81％(約2.7 Gb)，顯著高于番茄、馬鈴薯基因組中轉(zhuǎn)座元件所占的比重（約61％）。大部分植物中已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件均在辣椒基因組中存在，包括占基因組70.3％的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)轉(zhuǎn)座子和4.5％ DNA轉(zhuǎn)座子。這表明LTR轉(zhuǎn)座子可能導(dǎo)致了辣椒基因組的擴(kuò)增，遠(yuǎn)大于其在番茄（占基因組的50.3％）、馬鈴薯（占基因組的47.2％）和葡萄（占基因組的46.2％）中對(duì)基因組的貢獻(xiàn)，與玉米基因組中LTR

6、轉(zhuǎn)座子的貢獻(xiàn)（占基因組的75％）非常相似。在LTR轉(zhuǎn)座子中，權(quán)重最高的是Gypsy類(54.5％)和Copia類(8.6％)轉(zhuǎn)座子。這和單子葉植物如小麥基因組中LTR轉(zhuǎn)座子的分布不同，后者Copia類轉(zhuǎn)座子是DNA重復(fù)序列中比例最高的。在辣椒所有鑒定的轉(zhuǎn)座元件中，與番茄、馬鈴薯相比較，分別有23.1％和16.2％是祖先的重復(fù)序列，它們?cè)诜?、馬鈴薯與辣椒分化之前就已經(jīng)存在。在進(jìn)化分支上，辣椒屬和番茄屬分開后，發(fā)生了基因組的擴(kuò)增，新產(chǎn)生了

7、一些特異的轉(zhuǎn)座元件，它們占基因組的50.8％，其中LTR轉(zhuǎn)座子是其最主要的類型。
　　為分析辣椒基因組的擴(kuò)增，利用序列分歧分析估算所有LTR轉(zhuǎn)座子的插入時(shí)間。分析發(fā)現(xiàn)，從300萬(wàn)年前開始，辣椒屬的基因組逐漸有LTR轉(zhuǎn)座子的插入;從100萬(wàn)年前開始，LTR轉(zhuǎn)座子的插入活性逐漸增強(qiáng)，在約30萬(wàn)年前時(shí)達(dá)到峰值，這表明茄科植物進(jìn)化過程中辣椒屬基因組的擴(kuò)增是近期發(fā)生的事件。進(jìn)一步分析Copia和Gypsy類的插入時(shí)間和系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果和基于

8、所有LTR轉(zhuǎn)座子序列分歧分析的結(jié)果相近，這進(jìn)一步證實(shí)了上述推論。自茄科植物分化后，Gypsy類轉(zhuǎn)座子比Gypsy類具有更強(qiáng)的插入活性，并在辣椒基因組中占有最高的比例。
　　3.基因注釋和基因的轉(zhuǎn)錄
　　為注釋‘遵辣1號(hào)’和‘Chiltepin’的基因，通過對(duì)代表不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的30個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得90.5 Gb高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)?！窭?號(hào)’和‘Chiltepin’采用證據(jù)支持和從頭預(yù)測(cè)（de novo）

9、相結(jié)合的方法分別預(yù)測(cè)得到35，336和34，476個(gè)高度可信的蛋白編碼基因，獲得的基因數(shù)和番茄相近，略低于馬鈴薯、水稻或大白菜，高于其他五個(gè)物種（擬南芥、番木瓜、葡萄、西瓜、黃瓜）。兩個(gè)物種的基因在著絲粒附近的密度相對(duì)較低，但轉(zhuǎn)座元件在這些區(qū)域的密度卻很高，這表明重復(fù)序列在染色體上呈不均勻的散在分布。
　　通過對(duì)‘遵辣1號(hào)’花蕾的長(zhǎng)非編碼RNA測(cè)序，獲得2，717，180個(gè)序列片段。用自主開發(fā)的軟件鑒定得到6，527個(gè)lncRNA

10、s。根據(jù)其所處的位置，將這些lncRNA細(xì)分為5，976基因間lncRNA、222個(gè)內(nèi)含子重疊的lncRNA和329個(gè)雙向lncRNA。
　　采用生物信息學(xué)共鑒定到176個(gè)miRNA基因候選位點(diǎn)，其中有141個(gè)候選miRNA基因?qū)?yīng)于141個(gè)成熟的miRNAs，屬于35個(gè)保守的miRNA家族;其他為辣椒特異的miRNA，歸為29個(gè)新的家族。基于上述鑒定的176個(gè)miRNA（64個(gè)家族），采用生物信息學(xué)的方法共預(yù)測(cè)這些miRNAs的

11、1，104個(gè)靶基因，其中78％具有假定的功能。這些靶基因的結(jié)構(gòu)域的分析表明，32個(gè)miRNA家族通過靶向作用編碼轉(zhuǎn)錄因子的mRNAs，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起著重要的作用。
　　4.茄科植物的進(jìn)化
　　利用OrthoMCL軟件，鑒定了辣椒、番茄、馬鈴薯和擬南芥的基因家族。結(jié)果顯示，它們共同擁有10，279個(gè)基因家族，這些與生命攸關(guān)的重要基因（常被進(jìn)化生物學(xué)家稱為“核心基因”）古老而保守，以“生命的糧食”形式在物種之間代代相傳。辣椒共有

12、17，671基因家族，每個(gè)家族至少含有一個(gè)直系同源基因，其中的1，257個(gè)基因家族（含有3，143個(gè)基因）是辣椒特有的。這些特有基因主要富集在對(duì)生物刺激的響應(yīng)、蛋白質(zhì)水解等基因本體分類，從而使辣椒適應(yīng)廣泛的氣候環(huán)境。
　　我們還從葡萄、番木瓜、辣椒、番茄、馬鈴薯和擬南芥6個(gè)物種中鑒定了5，231個(gè)單拷貝的直系同源基因。以這些基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，雙子葉植物分化出茄科的時(shí)間幾乎在15，600萬(wàn)年之前，大概在單子葉植物和雙子

13、葉植物分開后不久。辣椒和馬鈴薯、番茄分開的時(shí)間大約在3600萬(wàn)年以前。
　　通過對(duì)辣椒與番茄、馬鈴薯基因組之間的比較分析，發(fā)現(xiàn)辣椒與后兩者之間分別存在1，052和799個(gè)大的共線性區(qū)域，同時(shí)也分別發(fā)生了612和430個(gè)染色體易位，這些易位幾乎分布在所有12條染色體上，另外還分別存在468和367個(gè)染色體的倒位。
　　通過辣椒與葡萄基因組之間的精細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)辣椒基因組曾發(fā)生了全基因組的三倍化事件，三倍化區(qū)域的序列占基因組的39

14、％，達(dá)到1.32 Gb;三倍化區(qū)域的基因數(shù)目達(dá)到23，017個(gè)，占總基因數(shù)目的65％。在進(jìn)化的過程中，祖先基因中有5，726個(gè)基因經(jīng)全基因組復(fù)制后所產(chǎn)生的3個(gè)拷貝僅保留一個(gè)拷貝，有723個(gè)基因保留了2個(gè)拷貝，有45基因保留了3個(gè)拷貝，另外有2，675個(gè)基因的3個(gè)拷貝竟然完全丟失。
　　基于組裝結(jié)果，通過物種間比較共線性片段內(nèi)旁系基因的4DTv(four-folddegenerate sites)突變率估算了基因組的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)在0.

15、48和0.3處分別出現(xiàn)了辣椒、番茄和馬鈴薯之間共同的峰，由此估計(jì)出辣椒的祖先與葡萄的分化發(fā)生在大約8，900萬(wàn)年前，經(jīng)歷了第一次三倍化的復(fù)制過程，另一次則發(fā)生在6000萬(wàn)年前，巧合的是——這段時(shí)間正是許多恐龍物種滅絕的時(shí)期?；蛟S這兩次基因組復(fù)制事件正是辣椒、番茄和馬鈴薯的祖先在該時(shí)期得以幸存的原因。另外，辣椒還有一次特異復(fù)制，由此估計(jì)辣椒與番茄、馬鈴薯的分化發(fā)生在大約2，000萬(wàn)年前，沒有證據(jù)表明在此之后經(jīng)歷了全基因組的復(fù)制，進(jìn)一步證實(shí)

16、了轉(zhuǎn)座子元件的擴(kuò)張是導(dǎo)致辣椒基因組擴(kuò)增的主要原因。
　　5人工選擇的分子印跡
　　對(duì)18個(gè)辣椒栽培材料、2個(gè)野生/半野生材料進(jìn)行重測(cè)序（測(cè)序深度為20x～30x，覆蓋度83％以上）后，共獲得845，020 Gb的數(shù)據(jù)量。經(jīng)過分析，每個(gè)樣品平均得到9，826，526個(gè)SNP和237，509個(gè)小的(＜5bp) InDel。從總SNP的數(shù)目來看，野生/半野生材料比栽培材料具有更多的遺傳多樣性。為在基因組水平上檢測(cè)栽培辣椒和野生/半

17、野生辣椒的差異，我們用Clustal X構(gòu)建了一個(gè)Neighbor-joining無根系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，栽培辣椒形成一個(gè)類群，野生種/半野生辣椒形成另一個(gè)類群。用貝葉斯聚類的方法(K=2-5)分析上述材料的群體結(jié)構(gòu)，栽培種能夠形成一個(gè)亞群，保持相對(duì)的一致，與野生種/半野生種分離開。當(dāng)K=5時(shí)，栽培種之間的區(qū)分最為明顯，而且還發(fā)現(xiàn)很多栽培材料內(nèi)含有野生材料的血緣，這在CM334、ZJ14、ZJ19、11c1363、ZJ18和Z兒2中表

18、現(xiàn)得尤為明顯，表明近期有從野生材料(如Chiltepin)到栽培材料的基因滲入。
　　為進(jìn)一步檢測(cè)馴化導(dǎo)致的栽培辣椒群體多態(tài)性的降低，我們使用滑動(dòng)窗口策略來估計(jì)栽培種群體的θπ和θw值。在栽培材料群體中共鑒定到115個(gè)具有強(qiáng)烈選擇掃蕩信號(hào)的區(qū)域，區(qū)域序列總長(zhǎng)度85.2 Mb，占基因組序列的2.6％，這些區(qū)域含有511個(gè)選擇的“候選基因”。，它們分布在不同染色體上;人工選擇區(qū)域長(zhǎng)度從0.3 kb到61.9 kb不等，且多態(tài)性水平相對(duì)

19、較低，說明這些區(qū)域是受人工馴化影響的。對(duì)獲得的511個(gè)“候選基因”進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明受人工選擇的“候選基因”主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、壓力和/或防御響應(yīng)、蛋白-DNA復(fù)合物的組裝、生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育，其中有34個(gè)包括AP2、ERF和bHLH家族在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子和10個(gè)含有NB-ARC域的抗病蛋白基因。上述“候選基因”可能解釋栽培辣椒和野生辣椒之間存在的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的差異。
　　6.辣椒和番茄果實(shí)發(fā)育的比較
　　通過比較番茄和辣椒

20、果實(shí)成熟期（6個(gè)轉(zhuǎn)色期前的階段、轉(zhuǎn)色期和3個(gè)轉(zhuǎn)色后階段）的基因表達(dá)模式，結(jié)果表明，番茄有2，281個(gè)差異表達(dá)基因，但辣椒只有1，440個(gè)，這些基因都參與了番茄和辣椒的細(xì)胞壁重塑、激素信號(hào)傳導(dǎo)和新陳代謝、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)降解和非生物壓力響應(yīng)等。番茄和辣椒果實(shí)在成熟期基因的表達(dá)差異在一定程度上可能反映了具有轉(zhuǎn)變期的果實(shí)（如番茄）和沒有轉(zhuǎn)變期的果實(shí)（如辣椒）之間的差異，從而造成后者具有較慢的變軟過程，以及對(duì)乙烯處理沒有響應(yīng)的后果。

21、r>　　7.辣椒素生物合成相關(guān)基因的進(jìn)化
　　基于前人對(duì)辣椒辣味相關(guān)基因的研究，本研究鑒定了參與辣椒素生物合成的51個(gè)基因家族，同時(shí)還鑒定了這些基因在番茄、馬鈴薯和擬南芥等3個(gè)物種中的直系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，和番茄、馬鈴薯和擬南芥相比較，辣椒發(fā)生了12個(gè)基因家族的獨(dú)立復(fù)制（如ACLd,AT3，β-CT,C3H,CAD，CCR，KasⅠ和PAL基因家族）?；蚩截愔g的序列分歧可能導(dǎo)致不同的功能或新功能化，促進(jìn)了特異的辣椒素

22、生物合成的進(jìn)化。以?；D(zhuǎn)移酶3(AT3)為例，本研究鑒定了at3基因(Pun1)3個(gè)串聯(lián)拷貝(AT3-D1，AT3-D2和AT3-D3)，at3基因編碼?；D(zhuǎn)移酶，并擔(dān)當(dāng)一些辣椒品種辣味的調(diào)控子角色。和番茄和馬鈴薯AT同源基因比較，相鄰的?；D(zhuǎn)移酶基因AT3-D1和AT3-D2在保守的DFGWGKP motif發(fā)生一個(gè)氨基酸的突變(K390R)，這種突變可能導(dǎo)致AT3-D1和AT3-D2基因發(fā)生了功能的變化，能夠合成辣椒素并產(chǎn)生辣椒果實(shí)

23、獨(dú)特的辣味。
　　通過對(duì)不同辣度的辣椒果實(shí)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，隨著辣椒素含量的逐漸增加，除ACL-D4和ACL-D5基因外，其他參與辣椒素合成途徑的基因呈現(xiàn)組織/發(fā)育階段特異性表達(dá)，但是僅有CCoAOMT-D9，AT3-D1和AT3-D2等3個(gè)基因在辣椒果實(shí)發(fā)育階段顯著表達(dá)，而處于發(fā)育期的果實(shí)正是辣椒素合成的組織。基于深入的序列比較，發(fā)現(xiàn)在沒有辣味或者辣度極低的辣椒中AT3-D1基因有長(zhǎng)度不等的片段缺失，可能使該

24、基因失去調(diào)控功能，但AT3-D2基因卻正常表達(dá)，并且在這些辣椒果實(shí)中仍然存在痕量的辣椒素（人類可能感知不到這種極低的辣味），這可能是由AT3-D2基因負(fù)責(zé)合成的。在辣度不同的辣椒中，AT3-D1和AT3-D2在CDS區(qū)都存在SNP，我們推測(cè)這兩個(gè)基因可能協(xié)同作用，合成并積累含量不同的辣椒素，這可能是一種與辣椒素積累相連的關(guān)鍵因素（或調(diào)控機(jī)制），可以決定不同品種辣椒的辣度。
　　辣椒基因組圖譜的完成將促進(jìn)辣椒抗性、品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀