抗結(jié)核藥物緩釋微球在兔椎體中釋放及分布規(guī)律的研究.pdf

1、研究背景:據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)到目前為止結(jié)核病仍然是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，目前全球有約1/3的人口被感染結(jié)核分枝桿菌。目前全世界結(jié)核病患者逾2000萬，每年新增近800萬，1993年WHO宣布了“全球進(jìn)入結(jié)核病緊急狀態(tài)”。據(jù)文獻(xiàn)報道在HIV陰性的患者約有3％-5％的患者在感染肺結(jié)核后出現(xiàn)脊柱結(jié)核，而HIV陽性患者這一數(shù)字則達(dá)到了60％，這向廣大醫(yī)務(wù)工作者和骨科工作者敲響了警鐘和提出了新的要求。我國1979年全國第一次結(jié)核病流

2、行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，活動性肺結(jié)核患病率717/10萬，全國約有活動性肺結(jié)核病人700萬，據(jù)專家估計(jì)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核占3％-5％，即有骨關(guān)節(jié)結(jié)核病人21萬-35萬。2000年全國第四次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，活動性肺結(jié)核患病率367/10萬。估計(jì)全國有活動性肺結(jié)核病人500萬，如按3％-5％計(jì)算，現(xiàn)有骨關(guān)節(jié)結(jié)核病人15-25萬。外科手術(shù)可以直接切除脊柱結(jié)核病灶，但不能完全清除結(jié)核菌。而手術(shù)放置內(nèi)固定則有可能成為術(shù)區(qū)殘留結(jié)核菌粘附的金屬床，加上

3、骨骼特殊的成分和生理活性，以及抗結(jié)核藥物自身半衰期較短和組織滲透性差的特點(diǎn)，治療藥物按一般給藥途徑難以有效轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位，成為了脊柱結(jié)核術(shù)后復(fù)發(fā)的一個重要原因。在脊柱結(jié)核外科手術(shù)結(jié)束時往往會在術(shù)區(qū)局部放置抗結(jié)核藥物，但是局部的藥物會隨血液循環(huán)和自身的代謝迅速消失。聚乳酸(PLA)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于載藥釋放系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，其中外消旋聚乳酸(D，L-polylactic-acid，PDLLA)是經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用作醫(yī)用手術(shù)防粘連膜和注射用微膠囊、

4、微球及埋植劑等緩釋制劑的材料。羥基磷灰石(簡稱HA)，分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，其組成和結(jié)構(gòu)均與人體硬組織（骨骼，牙齒）中的無機(jī)成份相似，具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，植入人體后能與原骨組織形成生理結(jié)合。因此本題提出了設(shè)計(jì)了兩種組織相容性好，緩釋效果理想的抗結(jié)核藥緩釋載體，通過在術(shù)區(qū)埋置抗結(jié)核藥物緩釋劑，使骨骼中的抗結(jié)核藥物濃度長期保持在有效殺菌藥物濃度，并對緩釋劑的離體釋放和在動物椎骨中釋放進(jìn)行濃度檢測。從而有效地提高

5、脊柱結(jié)核的療效，減少脊柱結(jié)核術(shù)后的復(fù)發(fā)，為骨結(jié)核的治療提供理論依據(jù)和治療手段。
　　 本文對實(shí)驗(yàn)動物脊柱骨內(nèi)埋置抗結(jié)核藥物緩釋劑后外周血液持續(xù)給予五聯(lián)抗癆藥物，采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對藥物濃度進(jìn)行檢測（它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)）。對實(shí)驗(yàn)動物椎骨及外周血液中異煙肼(INH)，利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)，鏈霉素(MS)及乙胺丁醇(EMB)五種一線抗結(jié)核藥物的濃度進(jìn)

6、行了全面檢測。探討正規(guī)化療及埋置緩釋劑后抗結(jié)核藥物在實(shí)驗(yàn)動物脊柱骨中的分布情況，為探索進(jìn)一步提高脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)的患者術(shù)區(qū)抗結(jié)核藥物濃度提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.尋找一種能夠在脊柱結(jié)核病灶術(shù)區(qū)內(nèi)持續(xù)長時間釋放抗結(jié)核藥物的緩釋載體，保障術(shù)區(qū)保持長期的有效殺菌濃度。
　　 2.尋找出一種一次性進(jìn)樣檢測全部一線五種抗結(jié)核藥物濃度的檢測方法，并確保該方法檢測結(jié)果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　

7、3.對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行造模干預(yù)后模擬人體抗結(jié)核治療的過程，檢測其病灶內(nèi)的藥物濃度并與人體抗癆治療后藥物濃度作比較，將異煙肼緩釋微球放入實(shí)驗(yàn)動物病灶中進(jìn)行濃度檢測了解其代謝和分布規(guī)律。
　　 方法:
　　 1.尋找出一種能夠在脊柱結(jié)核病灶術(shù)區(qū)內(nèi)持續(xù)長時間釋放抗結(jié)核藥物的緩釋載體
　　 (1)采用復(fù)乳-溶媒揮發(fā)法制備異煙肼聚乳酸微球
　　 ①分別稱量聚乙烯醇4 g和1 g加入超純水各100ml，加熱至100(℃)

8、后充分?jǐn)嚢枞芙饩垡蚁┐紴?％和1％ PVC液各100ml備用。
　　 ②稱量INH標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，溶于4％ PVC液1 ml中;稱量PLGA25 mg溶于2 ml二氯甲烷中。
　　 ③將含INH的4％ PVC液體倒入二氯甲烷溶液中，冰水沖浴下磁力攪拌，分散1 min，形成W/O液(water/oil)。
　　 ④倒入1％ PVC液10ml，攪拌10 min，形成W/O/W。將W/O/W倒入1％PVC20 ml中

9、攪拌12-18 h，擴(kuò)散有機(jī)相。
　　 ⑤將全部液體高速離心4000轉(zhuǎn)/min離心10 min得漂浮白色顆粒，將白色顆粒用BPS液體沖洗后再次離心，收集離心后的BPS液體測試紫外，取頂部白色漂浮物再次BPS液沖洗，離心，循環(huán)三次后用稱量紙包裹白色顆粒晾曬干燥后備用。
　　 (2)采用壓力滲透技術(shù)備制羥基磷灰石異煙肼微球
　　 ①稱取質(zhì)量比為10∶10∶80的Li2CO3，CaCO3，H3BO3粉料充分混合。

10、>　　 ②混合物置于硅碳棒高溫爐中，在1100℃下加熱熔融15 min后冰水急速淬冷。
　　 ③將混合物干燥破碎后篩取100-140目（每平方英時篩網(wǎng)上的孔眼數(shù)目）之間的顆粒，再至于800℃管式爐中球化兩次。
　　 ④將球化后的顆粒置于K2HPO4(0.25 mol/L，pH=9)溶液中，靜置于37℃恒溫箱中一周后取出。
　　 ⑤用去離子水充分洗滌后再90℃恒溫干燥24 h，然后將微球置于800℃馬弗爐中加熱2

11、h，冷卻后即得到多孔HA微球。
　　 ⑥稱量異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品23.4 mg加入超純水1ml，超聲10 min后加溫至90(℃)充分溶解藥物備用。
　　 ⑦稱量制備好的羥基磷灰石0.100 g放入50 ml燒杯，再放入真空干燥箱中保持真空度＜0.058 MPa放置12h，以排除微球孔隙中的氣體增加載藥量，異煙肼藥液倒入微球超聲15 min，放置24 h。
　　 ⑧將全部液體高速離心4000轉(zhuǎn)/min離心10 min將上

12、清液收集測試紫外。取底部白色沉淀再次BPS液沖洗，離心，循環(huán)三次后用稱量紙包裹白色顆粒晾曬干燥后備用。
　　 2.尋找出能一次性進(jìn)樣檢測全部一線五種抗結(jié)核藥物濃度的檢測方法，并確保該方法檢測結(jié)果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　 (1)確定出檢測的HPLC-MS條件
　　 ①色譜柱:親水性高效液相色譜(HILIC)柱(150mm×2.1 mmI.D.，3μm(Thermo，USA)。柱前連接有一個RRLC在線過濾

13、器(Agilent, Germany)。柱溫:40(℃)。
　　 ②流動相:由甲醇和含0.1％甲酸的5mM乙酸銨溶液(65∶35，v/v)組成。流速:0.5 mL/min。進(jìn)樣量:5μL。
　　 ③質(zhì)譜離子化方式:正離子電噴霧離子化(ESI+)。采用多級反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行定量，相應(yīng)的MRM離子對和質(zhì)譜參數(shù)為。ESI+條件:噴霧電壓5000V;離子源溫度700℃;氣簾氣15 psi，碰撞活化參數(shù):M;霧化氣:7

14、0psi;輔助氣:65 psi。
　　 (2)樣品提取過程
　　 ①樣品提取溶液:含5mM乙酸銨、0.1％甲酸和10％水的甲醇溶液。
　　 ②100μl標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品或質(zhì)控樣品加50μl內(nèi)標(biāo)工作液和300μl樣品提取溶劑。待測血漿樣品100μl，加50μL內(nèi)標(biāo)工作液和300μl樣品提取溶劑。
　　 ③樣品經(jīng)充分渦旋2 min后，于13000rpm離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至自動進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣5μl。<

15、br>　　 (3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　 得出9個濃度低度的色譜圖，再以五種藥物的峰面積為X軸、三種藥物的濃度為Y軸作線性性分析。
　　 RPZA=0.9982, RINH=0.9973,RSM=0.9963, REMB=0.9921, RRFP=0.9973
　　 YPZA=0.000377x+0.00577
　　 YINH=0.000654x+0.00384
　　 YSM=8.7e-005x-0

16、.000435
　　 YEMB=0.104x+0.0596
　　 YRFP=0.00137x+0.00199
　　 (4)樣品處理
　　 ①取樣品血漿100μl，加內(nèi)標(biāo)液50μl，加提取液300μl（流動相/甲醇=65∶35），渦旋15 min后離心10 min取上清液進(jìn)樣。
　　 ②骨組織樣品則加入200μl骨組織提取液，加內(nèi)標(biāo)液50μl，加提取液300μl（流動相/甲醇=65∶35），渦旋15

17、 min后離心10min取上清液進(jìn)樣。
　　 ③得5種抗結(jié)核藥物和2中內(nèi)標(biāo)藥物質(zhì)譜圖，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出藥物濃度。
　　 3.對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行造模干預(yù)，模擬人體結(jié)核抗癆治療的過程，為脊柱結(jié)核的基礎(chǔ)研究搭建實(shí)驗(yàn)動物平臺。
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備
　　 ①新西蘭白兔（成年2-3歲）共38只（清潔級），雌雄不限。飼養(yǎng)條件為:23℃左右，相對濕度:70％左右，標(biāo)準(zhǔn)兔飼料飼養(yǎng)2周（基本熱量需求）。
　　 ②

18、提前一個月對新西蘭兔予以地塞米松注射液(Dexamethasone，DSMS)0.32 mg iv QOD（按照0.16 mg/公斤折算），一周后改為片劑喂飼給藥0.06 mg poQD（按照0.03 mg/公斤折算），抑制其體液免疫和細(xì)胞免疫。
　　 (2)菌株備制過程
　　 ①將牛型結(jié)核分枝桿菌減毒菌株BCG在改良Sauton液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增2～3周。
　　 ②分裝于離心管，離心后用10％小牛血清培養(yǎng)液稀

19、釋成均勻的5mg/ml混懸液，常溫放置待用。使用時再次稀釋并鏡下調(diào)整濃度為1×105/ml。
　　 (3)菌株接種過程。
　　 ①麻醉滿意后常規(guī)碘酒消毒，酒精脫碘，鋪無菌巾，術(shù)前器械高溫消毒，取雙側(cè)第12肋末端連線的中點(diǎn)向下至雙側(cè)髂嵴連線的中點(diǎn)作約4 cm縱向切口的后正中入路，顯露腰4、5椎體棘突及棘上韌帶。
　　 ②于腰5椎體左側(cè)近椎間盤處緊貼椎體皮質(zhì)骨部由上往下剝離，暴露腰5椎體的左半部。用電動球磨鉆機(jī)在腰5

20、椎體上鉆一骨孔，深度約為0.4 cm、孔徑約0.25 cm，骨孔道止血后填入醫(yī)用明膠海綿，在明膠海綿上用注射器緩慢注射BCG菌株懸液0.1 ml。
　　 ③1-0號絲線間斷關(guān)閉切口，關(guān)閉深筋膜后皮下涂灑注射用青霉素粉劑(30萬U/只)，縫合皮膚后再次酒精消毒，無菌紗布覆蓋切口上，并固定好。
　　 ④將動物松綁后送入3P級飼養(yǎng)房內(nèi)飼養(yǎng)。
　　 結(jié)果:
　　 1.制作一種能夠在脊柱結(jié)核病灶術(shù)區(qū)內(nèi)持續(xù)長時間釋放

21、抗結(jié)核藥物的緩釋載體，保障術(shù)區(qū)保持長期的有效殺菌濃度。
　　 ①聚乳酸異煙肼微球孔隙率為63.68％，羥基磷灰石異煙肼微球孔隙率為82.18％。
　　 ②聚乳酸異煙肼微球載藥率為26.62％，包封率為28.35％。羥基磷灰石異煙肼微球載藥率為10.45％，包封率39.87％。
　　 ③兩種緩釋微球均能在第52天釋放出有效殺菌濃度的異煙肼。
　　 2.尋找出一種一次性進(jìn)樣檢測全部一線五種抗結(jié)核藥物濃度的檢測

22、方法，并確保該方法檢測結(jié)果符合生物樣本濃度檢測的要求。
　　 ①本題所采用的質(zhì)譜條件下可以一次性進(jìn)樣品檢測出全部五種一線抗結(jié)核藥物濃度，檢測時間控制在3分鐘以內(nèi)，效率比單純的液相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測大大提高。
　　 ②INH，RFP，PZA，SM和EMB回收率:分別為98.1％，97.6％，98.3％，98.1％和97.9％。日間及夜間變異率:在5.6％-12.3％。INH，RFP，PZA，SM，和EMB。精密度:分別為0.

23、212％，0.119％，0.103％，0.351％和0.209％。
　　 3.對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行造模干預(yù)后模擬人體抗結(jié)核治療的過程，檢測其病灶內(nèi)的藥物濃度并與人體抗癆治療后藥物濃度作比較，將異煙肼緩釋微球放入實(shí)驗(yàn)動物病灶中進(jìn)行濃度檢測。
　　 ①采用牛型結(jié)核分枝桿菌減毒菌株BCG造模的實(shí)驗(yàn)動物，病灶組織學(xué)改變同H37R(V)菌株存在很大差異，但形態(tài)學(xué)改變上有一定的相似性。
　　 ②實(shí)驗(yàn)動物病灶內(nèi)的抗結(jié)核藥物濃度與人體

24、脊柱結(jié)核病灶內(nèi)藥物濃度有一定差異。實(shí)驗(yàn)動物服藥后抗結(jié)核藥物原藥的濃度在髂骨和病灶中較為相似，在血液中存在少許差異。（2小時FRFP血=8.544，PRFP血=0.015，3小時FRFP血=6.182PRFP血0.040）而其代謝產(chǎn)物的差異則更為明顯。
　　 ③在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)埋置異煙肼緩釋微球，能有效的長期保持局部抗結(jié)核藥物的高濃度水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.聚乳酸和羥基磷灰石異煙肼微球能在術(shù)區(qū)內(nèi)緩慢釋放，長期