自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于小型豬全脫位牙延遲再植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙全脫位(Completely avulsed teeth，CAT)是造成兒童年輕恒牙早失的主要疾病之一。牙齒離體時(shí)間、細(xì)胞活力和微環(huán)境是影響牙再植治療成功與否的主要因素。研究證實(shí)，當(dāng)牙齒離體1個(gè)小時(shí)，且沒有保存在特殊的儲(chǔ)存液中，根面幾乎找不到生活的牙周成纖維細(xì)胞，而牙根及牙槽窩中是否存有足夠生活的組織細(xì)胞對(duì)外傷牙牙周組織的愈合起著決定性的作用。然而，牙外傷多為突發(fā)事件，上述因素很難在就診前被控制，目前，臨床醫(yī)師多采取國際牙外傷聯(lián)合委員

2、會(huì)制定的各類牙外傷操作指南進(jìn)行臨床治療，對(duì)于CAT主要依靠患者自身的再生能力來完成整個(gè)牙周組織的損傷修復(fù)，療效十分局限，加之干擾因素較多，個(gè)體間可比性差，臨床治療難以得到突破性進(jìn)展。近年來組織工程技術(shù)在牙周再生治療中已顯現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)，如果能在牙根表面和牙槽窩中回植足夠數(shù)量的生活細(xì)胞，那么牙齒離體時(shí)間的長短對(duì)治療效果的影響將會(huì)大大降低。研究表明牙周膜干細(xì)胞是牙周組織理想再生的首選細(xì)胞，然而自體牙周膜干細(xì)胞來源有限，尤其是在外傷牙的案例中更難

3、獲得。近年來非牙源性干細(xì)胞再生牙齒組織已成為一種選擇。在諸多非牙源性干細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是較為成熟的一類，研究證明在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亦可分化成類成牙骨質(zhì)細(xì)胞，類牙周膜細(xì)胞和類骨細(xì)胞，完成理想牙周復(fù)合體再生的過程，異體移植所帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)也將會(huì)避免，這將極大推進(jìn)全脫位牙再植治療效果，降低并發(fā)癥帶來的失牙風(fēng)險(xiǎn)。然而將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于CAT延遲再植的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)此方法在臨床應(yīng)用中的可行性，

4、本研究將著力探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞再生牙周組織的潛力，并利用小型豬建立全脫位牙動(dòng)物模型，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞再生牙周復(fù)合體的相關(guān)機(jī)理，為自體非牙源性干細(xì)胞再生牙體組織尋找理論依據(jù)。本研究包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分，小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定
　　目的:建立穩(wěn)定的小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定，為后期研究提供基礎(chǔ)和前提。
　　方法:以四川達(dá)碩小型豬為研究對(duì)象，全麻下抽取其髂骨

5、骨髓血，采用Ficoll淋巴細(xì)胞密度梯度離心法處理血樣，待樣本分層后，吸取單核細(xì)胞層細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀，細(xì)胞生長曲線，免疫組化染色，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀等對(duì)所獲細(xì)胞生長特性，多項(xiàng)誘導(dǎo)分化能力和表面特異標(biāo)記物進(jìn)行觀察和分析，初步鑒定干細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性。
　　結(jié)果:鏡下觀分離所獲小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成長梭形渦旋式生長，生長狀態(tài)良好。P1細(xì)胞克隆形成率為10.28±0.69％，活細(xì)胞比率為98.17±1.89％，流

6、式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面特異標(biāo)記物CD44和CD105呈陽性表達(dá)，分別為76.5％和92.6％; CD45和CD34呈陰性表達(dá)，分別為5.9％和2.3％。多項(xiàng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)小型豬間充質(zhì)干細(xì)胞有成骨成脂分化潛能。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)采用Ficoll淋巴細(xì)胞密度梯度法成功分離獲得小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分離所獲細(xì)胞增殖能力旺盛，具有跨胚層橫向分化潛能。
　　第二部分，小型豬牙周膜干細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞牙向分化的體外研究
　　

7、目的:在體外研究小型豬牙周膜干細(xì)胞對(duì)其髂骨骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞牙向分化的作用，尋找二者最佳配比比例，為證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以獲得牙源性干細(xì)胞特性，具備同時(shí)再生牙周軟硬組織，達(dá)到牙周理想再生的能力尋找理論依據(jù)。
　　方法:應(yīng)用Transwell小室法對(duì)小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。根據(jù)兩類細(xì)胞的混合比例將其隨機(jī)分為3組:A組:P∶M=10∶1共培養(yǎng)組;B組:P∶M=1∶1共培養(yǎng);C組:P∶M=1∶10共培

8、養(yǎng)，單獨(dú)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)組分別為陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。培養(yǎng)14 d，應(yīng)用免疫熒光染色，實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime-PCR)和Western blot法分別檢測(cè)成骨細(xì)胞和牙周成纖維細(xì)胞的特異蛋白:scleraxis、osteocalcin(OCN)、osterix(OSX)、matrixextracellular phosphoglycoprotein(MEPE)等mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以判定二者的最佳配比比

9、例。
　　結(jié)果:免疫熒光染色，Realtime-PCR和Western blot結(jié)果顯示，A、B、C三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，牙周膜干細(xì)胞特異蛋白sceleraxis，MEPE和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)特異蛋白OCN和OSX相對(duì)mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)。數(shù)據(jù)顯示:A組對(duì)四種蛋白的表達(dá)水平最高。其中在牙周特異蛋白sceleraxis，MEPE的表達(dá)上A組與其它兩組之間出現(xiàn)了明顯的差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。而在骨髓特異蛋白O

10、CN和OSX的表達(dá)上，雖然仍高于其他兩組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。此外，B、C兩組與陰陽兩個(gè)對(duì)照組相比，以上四種蛋白的表達(dá)水平均出現(xiàn)了較為明顯的變化，如:sceleraxis，MEPE的表達(dá)均高于陰性對(duì)照組，但還達(dá)不到陽性對(duì)照組的水平，而OCN和OSX的表達(dá)均高于兩個(gè)對(duì)照組，尤其是OSX與陽性對(duì)照組相比有更為顯著的差別，P＜0.01。但B、C兩組之間各蛋白的表達(dá)均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　結(jié)論:聯(lián)合培養(yǎng)可促進(jìn)骨

11、髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得部分牙周膜干細(xì)胞的特性，且少量的牙周膜干細(xì)胞同樣可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得牙源性干細(xì)胞特性。
　　第三部分，小型豬自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于全脫位牙延遲再植治療的體內(nèi)研究
　　目的:在體內(nèi)研究誘導(dǎo)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在牙延遲再植治療中再生牙周復(fù)合體的作用，探索適合臨床實(shí)際操作的全脫位牙牙周組織再生技術(shù)。
　　方法:選擇6只3-4月齡四川達(dá)碩小型豬的60顆牙齒為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)前2周，準(zhǔn)備P3自體imp

12、BM-MSCs（P∶M=1∶10共培養(yǎng)14天），mpBM-MSCs和mpPDLSCs。術(shù)前并將各類細(xì)胞調(diào)整至2×107個(gè)/ml備用，手術(shù)建立全脫位牙模型，將拔除的受試牙至于體外干燥環(huán)境中滯留1h，并在回植前，刮除牙根表面牙周膜組織。根據(jù)回植細(xì)胞種類，將其劃分為4組:A組:空白對(duì)照組，直接將牙根表面處理后回植至牙槽窩;B組:mpBM-MSCs回植組;C組:impBM-MSCs回植組;D組:mpPDLSCs回植組。術(shù)后6w檢測(cè)牙周再生相關(guān)臨

13、床和影像學(xué)指標(biāo)，制作組織學(xué)切片觀察牙周再生組織結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用Realtime-PCR檢測(cè)牙周組織特意蛋白COLI，Scleraxis，MEPE和DSPP等蛋白相對(duì)mRNA表達(dá)水平，了解各組牙周再生能力。
　　結(jié)果:成功建立牙齒全脫位模型。術(shù)后6w對(duì)各組受試牙齒的臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過三類細(xì)胞介導(dǎo)的牙齒延遲再植治療組與空白對(duì)照組相比，PD，GR，Al，BI指數(shù)均較低，基本可以達(dá)到術(shù)前水平?？瞻捉MGR出現(xiàn)負(fù)值，說明牙齦出現(xiàn)退縮。在牙齒松動(dòng)度

14、的檢測(cè)上，空白對(duì)照組與另外3組相比，仍有近3度的松動(dòng)，而3個(gè)實(shí)驗(yàn)組松動(dòng)度基本恢復(fù)到術(shù)前標(biāo)準(zhǔn)。影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組出現(xiàn)了常見的牙再植術(shù)術(shù)后并發(fā)癥-牙根外吸收，較為嚴(yán)重的出現(xiàn)了病理性骨折，而經(jīng)過細(xì)胞介導(dǎo)的牙再植治療，牙齒幾乎沒有出現(xiàn)以上并發(fā)癥，但部分牙齒的局部出現(xiàn)淺表性吸收，但范圍較小。組織學(xué)切片觀察顯示，經(jīng)過細(xì)胞介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了牙周膜組織再生，在切片中可以清晰辨認(rèn)牙周韌帶，Sharp穿通纖維和血管等解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，而空白對(duì)照組僅

15、在牙根局部發(fā)現(xiàn)少量的正常牙周膜組織，大部分牙周組織結(jié)構(gòu)破壞，牙根外吸收是主要的病理學(xué)改變。在牙周組織特意蛋白DSPP和COLI的表達(dá)上，B組較C、D兩組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在其它兩個(gè)蛋白的比較中，三組表達(dá)水平相似，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05
　　結(jié)論:自體impBM-MSCs可以在移植后獲得更多牙源特性，治療效果近似PDLSCs，較直接通過自體mpBM-MSCs移植具有一定優(yōu)勢(shì)，但考慮臨床實(shí)際可實(shí)施性，認(rèn)為單獨(dú)回植自體mpB