hUCMSCs移植對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢儲(chǔ)備功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　1.探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)移植對(duì)自然衰老圍絕經(jīng)期SD大鼠（以下簡(jiǎn)稱圍絕經(jīng)期SD大鼠）卵巢儲(chǔ)備功能的影響;
　　2.探討hUCMSCs移植對(duì)圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的影響;
　　3.探討hUCMSCs移植提高圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的可能途徑;
　　4.探討hUCMSCs移植到圍絕經(jīng)期SD大鼠體內(nèi)的安全性及可行性。
　　[方法]
　　陰道

2、脫落細(xì)胞涂片法監(jiān)測(cè)動(dòng)情周期變化，篩選出30只月齡13～15個(gè)月的SPF級(jí)圍絕經(jīng)期SD大鼠模型，隨機(jī)分為A、B、C組（每組10只），所有圍絕經(jīng)期SD大鼠生活條件及喂養(yǎng)方式相同。A組不予處理，B組經(jīng)尾靜脈移植濃度為1×106細(xì)胞/ml的hUCMSCs單細(xì)胞懸液1ml，隔日1次，共2次;C組與B組相同方法和實(shí)驗(yàn)時(shí)間移植細(xì)胞緩沖液（以下簡(jiǎn)稱PBS液）1ml。于成模時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d和14d時(shí)（即B組和C組末次移植后7d和14d時(shí)）檢測(cè)各組圍絕經(jīng)期

3、SD大鼠激素:E2、P、LH、FSH的水平，INHB、AMH水平，觀察實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d、14d時(shí)各組圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化和細(xì)胞凋亡情況。
　　[結(jié)果]
　　1.SD大鼠陰道脫落細(xì)胞的變化:連續(xù)10天呈現(xiàn)動(dòng)情周期的紊亂、持續(xù)動(dòng)情或間期延長(zhǎng)等變化，證實(shí)入選的SD大鼠為圍絕經(jīng)期模型。
　　2.實(shí)驗(yàn)期間圍絕經(jīng)期SD大鼠一般情況:3組圍絕經(jīng)期SD大鼠精神、飲食、毛色、活動(dòng)等情況良好，無(wú)出血等明顯不良反應(yīng)

4、，無(wú)死亡發(fā)生，移植組無(wú)明顯排斥反應(yīng)。
　　3.圍絕經(jīng)期SD大鼠血清AMH、INHB變化:3組圍絕經(jīng)期SD大鼠成模時(shí)及實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d時(shí)（即B組和C組末次移植后7d時(shí)）的AMH、INHB水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;B組圍絕經(jīng)期大鼠的AMH、INHB水平隨移植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，末次移植后14d時(shí)與末次移植后7d時(shí)、成模時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)（即B組和C組末次移植后14d時(shí)），B組與A、C組

5、圍絕經(jīng)期大鼠的AMH、INHB水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);A組和C組比較差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，A、C組圍絕經(jīng)期SD大鼠的AMH、INHB水平逐漸下降，實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)顯著低于成模時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明hUCMSCs移植后，在圍絕經(jīng)期SD大鼠體內(nèi)環(huán)境中末次移植后14d時(shí)比7d時(shí)對(duì)AMH、INHB水平產(chǎn)生影響大。因此本研究推測(cè)，hUCMSCs末次移植后14天時(shí)圍絕經(jīng)期SD大

6、鼠AMH、INHB水平明顯提高，可能是圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能提高了的表現(xiàn)之一。提示hUCMSCs移植對(duì)延緩圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降有積極意義。
　　4.圍絕經(jīng)期SD大鼠血清性激素變化:3組圍絕經(jīng)期SD大鼠成模時(shí)及實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d時(shí)E2、P、FSH、LH水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;B組圍絕經(jīng)期SD大鼠E2、P水平隨移植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，末次移植后14d時(shí)與末次移植后7d時(shí)、成模時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

7、05)。B組圍絕經(jīng)期SD大鼠FSH、LH水平隨移植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，末次移植后14d時(shí)與末次移植后7d時(shí)、成模時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)，B組與A組和C組圍絕經(jīng)期SD大鼠E2、P、FSH、LH水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;A組和C組比較差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，A、C組圍絕經(jīng)期SD大鼠E2、P水平逐漸下降，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)顯著低于成模時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0

8、5）。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，A、C組圍絕經(jīng)期SD大鼠FSH、LH水平逐漸上升，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)顯著高于成模時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此本研究推測(cè)，hUCMSCs移植一定時(shí)間后對(duì)圍絕經(jīng)期SD大鼠性激素變化產(chǎn)生顯著影響，可能是圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能提高了的表現(xiàn)之一。提示hUCMSCs移植一定時(shí)間后能改善圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能。
　　5.光鏡:HE染色后光鏡觀察，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d，3組圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢的形態(tài)學(xué)表

9、現(xiàn)為卵巢間質(zhì)致密，各期卵泡細(xì)胞較少，黃體發(fā)育不良且數(shù)目較少，可見較多的閉鎖卵泡，多數(shù)顆粒細(xì)胞消失。實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)B組與A、C組比較:光鏡下可見卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡形成的狀況有所改善，各級(jí)卵泡細(xì)胞增多;黃體數(shù)量及發(fā)育狀況與A、C組比較數(shù)目增多，閉鎖卵泡減少。形態(tài)學(xué)證實(shí)hUCMSCs移植一定時(shí)間后圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能有所改善。
　　6.電鏡:電鏡觀察，實(shí)驗(yàn)時(shí)間7d時(shí)，3組圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢組織的卵泡內(nèi)可見顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體較少、腫

10、大，空變及髓鞘樣變，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張，高爾基體肥大。顆粒細(xì)胞凋亡，胞質(zhì)濃縮，線粒體、溶酶體空泡化等細(xì)凋亡小體形成。實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)與A、C組比較，B組電鏡下卵巢卵泡內(nèi)可見顆粒細(xì)胞多層，呈立方形，顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，結(jié)構(gòu)較前趨于正常，凋亡小體數(shù)目減少。核孔增大，核孔與細(xì)胞代謝活性有改善。hUCMSCs移植后一定時(shí)間后，可見卵巢組織細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于更佳代謝狀態(tài)。提示hUCMSCs移植一定時(shí)間后卵巢細(xì)胞的

11、超微結(jié)構(gòu)有所改善。
　　7.卵巢組織細(xì)胞凋亡情況:免疫熒光染色后觀察，實(shí)驗(yàn)時(shí)間14d時(shí)，3組圍絕經(jīng)期SD大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)比較，A、C組中的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而且大部分都是卵泡周邊及內(nèi)部的顆粒細(xì)胞。B組卵泡內(nèi)外凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯減少，卵泡內(nèi)只有少數(shù)凋亡細(xì)胞。hUCMSCs移植一定時(shí)間后減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量是改善圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢的功能可能途徑之一。
　　[結(jié)論]
　　1.hUCMSCs移植對(duì)改善圍絕經(jīng)期SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功