牛ISG15基因、IL8基因遺傳多態(tài)性及其與乳質性狀和體細胞評分的關聯(lián)分析.pdf

1、不同泌乳時期水（奶）牛外周血白細胞牛全基因組表達譜芯片的數(shù)據(jù)分析表明，牛泌乳前期到中期、中期到后期有多個基因的表達量呈現(xiàn)2倍的上調或下調，其中ISG15和IL8均呈現(xiàn)泌乳前期到中期的表達下降，然后中期到后期的表達上升這樣一種趨勢。鑒于ISG15和IL8在先天性免疫和獲得性免疫中的重要作用，我們將ISG15和IL8基因作為牛疾病抗性的重要候選基因，利用cDNA末端快速擴增(rapidamplification of cDNA ends，R

2、ACE)技術克隆溫州水牛ISG15和IL8基因全長序列，分別設計覆蓋牛ISG15和IL8基因的聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)(Polymerase ChainReaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)引物，對比了中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺黃牛、魯西黃牛和溫州水牛IL8基因的單核苷酸多態(tài)性，中國荷斯坦牛、魯西黃牛和溫州水牛ISG15基因的單核苷酸多態(tài)性，并進行了這

3、些單核苷酸多態(tài)性與泌乳性狀的關聯(lián)分析，為提高?？共⌒阅芎透纳泼谌樾阅芴峁├碚摶A。
　　1溫州水牛ISG15基因克隆及其生物信息學分析
　　利用RACE技術獲得了溫州水牛ISG15基因的全長序列。該基因mRNA全長629bp，其中5'UTR長度為72 bp(1～72 bp);開放閱讀框465 bp(73～535bp)，編碼154個氨基酸;3' UTR92 bp(536～629 bp)。ISG15基因的DNA全長包括兩個外顯子

4、(1458～1460bp和1897～2424bp)和一個內含子(1461-1896bp)，基因結構與其它哺乳動物ISG15基因結構一致。推定的溫州水牛ISG15蛋白分子量為17333.1Da。溫州水牛ISG15蛋白與水牛(AAZ38149.1)同源性最高，為99％。ISG15蛋白亞細胞定位預測結果顯示，溫州水牛ISG15蛋白具有信號肽的幾率為13.8％。
　　2溫州水牛IL8基因克隆及其生物信息學分析
　　利用RACE技術獲

5、得了溫州水牛IL8基因的全長序列1522 bp。該基因mRNA5'UTR長度為82 bp(1～82 bp);開放閱讀框306 bp(83～388 bp)，編碼101個氨基酸;3'UTR1134 bp(389～1522 bp)。ISG15基因的DNA全長序列包括4個外顯子（74～137bp、1690～1839bp、2113～2196bp和2639～2660bp）和3個內含子(138～1689bp、1840～2112bp和2197～2638

6、bp)，基因結構與其它哺乳動物IL8基因結構一致。推定的溫州水牛IL8蛋白分子量為11305.4Da。溫州水牛IL8蛋白與水牛(AAW67481.1)和牛(ACI23534.1)同源性最高，為100％。生物信息學分析結果顯示，溫州水牛IL8蛋白的第31至92位氨基酸殘基處存在SCY功能域(Intercrine alpha family，chemokineCXC)。
　　3牛ISG15基因PCR-SSCP檢測及其多態(tài)性分析
　

7、　182頭中國荷斯坦奶牛尾靜脈血采自于浙江省金華市伊康乳業(yè)奶牛場。溫州水牛尾靜脈血采自浙江省溫州市平陽縣挺志溫州水牛乳業(yè)有限公司(32頭)和湖北省荊門市沙洋縣五里鎮(zhèn)奶水牛養(yǎng)殖示范基地（102頭）。19頭溫嶺高峰牛靜脈血采自溫嶺畜牧獸醫(yī)站。22頭天臺黃牛靜脈血采自天臺畜牧獸醫(yī)站。血液均經過EDTA Na2抗凝，以進行后續(xù)的外周血白細胞總RNA和DNA的提取。魯西黃?；蚪MDNA樣品(55個個體)由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所李俊雅研究

8、員提供。
　　使用了15對引物對中國荷斯坦牛、魯西黃牛和溫州水牛ISG15基因進行了PCR-SSCP檢測。中國荷斯坦牛群體內發(fā)現(xiàn)了g.2241G→A的突變，并且該突變屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。溫州水牛群體內則存在g.374G→A、g.433C→T、g.1806G→C和g.2104G→A這4個突變，其中g.374G→A和g.2104G→A屬于低度多態(tài)性(PIC＜0.25)，g.433C→T和g.1806G→C屬于中

9、度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。x2適合性檢驗結果表明，溫州水牛群體中g.433C→T和g.1806G→C偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)。魯西黃牛群體內未篩選到突變。
　　中國荷斯坦牛和溫州水牛篩選到的突變位點與乳質性狀的關聯(lián)分析結果表明，g.2241G→A可顯著影響中國荷斯坦牛的乳蛋白率(P＜0.05)，極其顯著影響中國荷斯坦牛的體細胞評分。溫州水牛群體內的突變位點與其乳質性狀關聯(lián)分析結果沒有發(fā)

10、現(xiàn)有顯著影響的關聯(lián)位點。
　　4牛IL8基因PCR-SSCP檢測及其多態(tài)性分析
　　使用了17對引物對中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺黃牛、魯西黃牛和溫州水牛IL8基因進行了PCR-SSCP檢測。中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺黃牛、魯西黃牛群體內發(fā)現(xiàn)了g.-63G→A、g.249 C→T、g.311 C→T、g.349 A→G、g.1247C→T、g.1501G→T、g.1939A→C、g.1986 G→A、g.2256 T→

11、G、g.2269 G→A、g.2420G→A、g.2831 A→G、g.2904 T→C和g.3030 G→A突變。均屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。貯適合性檢驗結果表明，g.1247C→T和g.1501G→T偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)。溫州水牛群體內未發(fā)現(xiàn)突變位點。
　　中國荷斯坦牛IL8基因的連鎖不平衡分析顯示，該基因內存在4個單倍域（Haplotype block），g.249 C→

12、T、g.1939 A→C、g.2256 T→G和g.2831 A→G為選擇的htSNP。 g.249 C→T與g.311 C→T、g.349 A→G, g.1939 A→C與g.1986 G→A, g.2256T→G與g.2269 G→A，g.2831 A→G與g.2904 T→C、g.3030 G→A之間的r2值為1，g.249 C→T可代替g.311 C→T和g.349 A→G效應，g.1939A→C可代替g.1986 G→A效應，

13、 g.2256 T→G可代替g.2269 G→A效應，g.2831A→G可代替g.2904 T→C和g.3030G→A效應。由g.249 C→T、g.1939A→C、g.2256 T→G和g.2831 A→G這四個htSNPs構建的單倍型即可反映整個基因的單倍型信息。
　　中國荷斯坦牛SNPs與乳質性狀的關聯(lián)分析結果表明，g.-63G→A對305天產奶量有顯著影響(P＜0.05)，各基因型乳蛋白率呈現(xiàn)出GG＞GA＞AA的趨勢。g.

14、249C→T對305天產奶量和乳脂率有顯著影響(P＜0.05)。g.1247C→T對體細胞評分有顯著影響(P＜0.05)，各基因型乳脂率和體細胞評分呈現(xiàn)出CC＜CT＜TT的趨勢。g.1501G→T對305天產奶量有顯著影響(P＜0.05)，各基因型305天產奶量呈現(xiàn)出GG＜GT＜TT的趨勢。g.1939A→C對泌乳性狀沒有顯著影響，但發(fā)現(xiàn)各基因型乳脂率和體細胞評分呈現(xiàn)出AA＜AB＜BB的趨勢。g.2256T→G對乳脂率有顯著影響(P＜0