紫金龍抗炎作用機理及質(zhì)量控制研究.pdf

1、目的：以杜仲藥材有效部位提取物為研究對象，在細胞水平上考察其抗骨質(zhì)疏松藥效作用，闡明杜仲藥材抗骨質(zhì)疏松作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。
　　方法：（1）采用大孔樹脂吸附法分離杜仲化學(xué)組分并用高效液相（UPLC）進行圖譜比對以探究組分制備的合理性；以對MC3T3-E1 subclone14成骨細胞及SAO-2人成骨細胞存活率、堿性磷酸酶活性、骨保護素（OPG）活性的影響，篩選杜仲抗骨質(zhì)疏松有效活性組分（2）在杜仲各化學(xué)組分UPLC圖譜

2、比對的基礎(chǔ)上,借助超高液相色譜–電噴霧–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對杜仲促成骨細胞增殖有效組分的化學(xué)成分進行質(zhì)譜分析研究。（3）采用 MC3T3-E1 subclone14成骨細胞存活率來篩選杜仲有效活性化學(xué)成分，然后應(yīng)用實時熒光定量 PCR技術(shù)和Western blot(蛋白質(zhì)印跡)技術(shù)從分子水平研究杜仲有效部位中的主要化合物對MC3T3-E1 subclone14成骨細胞中OPG，RANKL，RUNX-2，Os

3、terix及TRACP等基因表達的影響，同時使用酶聯(lián)免疫法檢測杜仲有效組分中的主要化合物對MC3T3-E1 subclone14成骨細胞中Ca2+，ALP，M-CSF及OTC等因子活性的影響。
　　結(jié)果：通過比對杜仲各化學(xué)組分高效液相(UPLC)圖譜發(fā)現(xiàn)水煎煮提取法明顯優(yōu)于乙醇回流提取法，水煎煮提取物經(jīng) D101大孔樹脂分段后各組分基本無交叉。杜仲水提取物經(jīng) D101大孔樹脂分離所得40％乙醇組分對成骨細胞具有促進增殖、促分化成熟

4、及促進OPG分泌水平的作用。利用超高液相色譜–電噴霧–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對40%乙醇組分進行質(zhì)譜分析比對，共指認10個化合物：京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷、刺五加苷E、松脂醇單葡萄苷、紫云英苷、黃芩苷。分子生物學(xué)實驗結(jié)果表明，京尼平苷酸、咖啡酸、紫云英苷、黃芩苷具有促成骨細胞增殖的作用并且能顯著提高Ca2+、ALP、M-CSF及OTC因子的表達，具有促進成骨細胞成熟分化的能

5、力。紫云英苷、黃芩苷能促進Ca2+及OTC的分泌。4個化合物中只有京尼平苷酸能明顯抑制M-CSF因子減少成骨細胞的轉(zhuǎn)換。Western blot實驗結(jié)果表明，紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸和京尼平苷酸能顯著的上調(diào)OPG/RANKL系統(tǒng)的表達。黃芩苷、紫云英苷還能提高RUNX-2蛋白的閾值，同時Osterix蛋白水平也隨著黃芩苷濃度升高而顯著上升。利用RT-PCR方法對成骨細胞TRACP因子考察發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸能濃度依賴性的抑制TRACP因子的

6、活性。
　　結(jié)論：杜仲40%乙醇組分是促成骨細胞增殖及分化成熟活性組分，該組分中的化合物紫云英苷、黃芩苷、京尼平苷酸和咖啡酸是杜仲抗骨質(zhì)疏松的活性成分。京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸具有顯著性的提高成骨細胞分化成熟的能力并且京尼平苷酸還能抑制成骨細胞轉(zhuǎn)化為破骨細胞，維持成骨細胞與破骨細胞的平衡。同時京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸能上調(diào) OPG/RANKL系統(tǒng)改善骨重建；紫云英苷、黃芩苷加強鈣離子與骨組織的結(jié)合能力輔助改