Kallikrein7基因在胃癌中的表達(dá)及其siRNA對胃癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 胃癌(GastricCarcinoma)是人類常見的惡性腫瘤之一，據(jù)國際癌癥研究中心(IARC，International Agency for Researchon Cancer)公布的最新統(tǒng)計結(jié)果，全球2008年新發(fā)胃癌病例數(shù)640031例，占當(dāng)年新發(fā)腫瘤患者的9.7％，是全世界第四大惡性腫瘤。特別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)，胃癌發(fā)病率僅次于肺癌名列第二[1]。依據(jù)中國腫瘤登記中心發(fā)布的《中國2009年腫瘤登記年

2、報》，胃癌在我國發(fā)病率僅次于肺癌列第二位(32.23/10萬)，發(fā)病前十位惡性腫瘤構(gòu)成中胃癌占15％。我國農(nóng)村地區(qū)和城市地區(qū)胃癌發(fā)病率不同，農(nóng)村地區(qū)發(fā)病率(53.5％)遠(yuǎn)高于城市(29.9％)，在農(nóng)村胃癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤。隨著醫(yī)療科技和診療技術(shù)的提高，近年來，胃癌死亡率呈下降趨勢，特別是2004年以后，胃癌已不是我國發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，但是，胃癌患者死亡率仍然較高，每年約有24萬人左右死于胃癌[2，3]。胃癌發(fā)病和死亡的原因

3、有很多，一些關(guān)鍵因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要作用，如遺傳和外部環(huán)境影響、飲食等，同時基因相互作用影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[4，5]。
　　 近年來，胃癌診斷取得一定進(jìn)展，共聚焦內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、內(nèi)鏡色素染色技術(shù)、內(nèi)鏡窄譜成像技術(shù)、內(nèi)鏡智能分光比色技術(shù)等各種內(nèi)鏡技術(shù)的應(yīng)用提高了早期胃癌的診斷率[6，7]。胃癌化療特別是術(shù)前新輔助放化療[8，9]、術(shù)中化療[10]、術(shù)后輔助放療[11]、化療[12]等不同治療方法一定程度提高了手術(shù)切

4、除率、改善了患者預(yù)后。盡管晚期或進(jìn)展期胃癌己探索出很多治療方法，但總體五年生存率仍然不樂觀，新的輔助手術(shù)進(jìn)行的放化療效果也有待長期觀察。
　　 胃癌發(fā)生的生物學(xué)行為、分子機制目前仍然不是很清楚[13]，大量研究均表明胃癌的發(fā)生發(fā)展是個復(fù)雜的綜合過程，故探尋胃癌發(fā)生發(fā)展機制，尋找可能存在、未被發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物及可能的腫瘤治療靶點，對于進(jìn)一步提高胃癌診治水平具有重要意義。
　　 Kallikrein7(KLK7)屬于人組織激肽釋

5、放酶(Kallikrein-related peptidases，KLKs)基因家族，既往的研究證實其在皮膚脫屑、表皮細(xì)胞粘附、皮膚損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[14]。新近研究認(rèn)為，KLKs基因家族不僅表達(dá)于皮膚、前列腺等組織，在人類多種腫瘤組織中也有表達(dá)。他們通過復(fù)雜的調(diào)控機制，參與了多種腫瘤的生長、發(fā)揮著不同的分子生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)KLK7在結(jié)腸癌癌組織中的高表達(dá)可以作為獨立的預(yù)后的因素，KLK7表達(dá)影響疾病轉(zhuǎn)歸和生存期。此外，多項研究結(jié)

6、果顯示，KLK7還可與microRNA一起參與體內(nèi)各種級聯(lián)調(diào)控，可見，KLK7除具有診斷特性外，有可能成為未來腫瘤治療的靶點基因。
　　 小分子干擾RNA(RNA interference，RNAi)作為成熟的基因研究技術(shù)，是使用特定雙鏈RNA片段高效阻斷體內(nèi)基因表達(dá)，從而促使靶向mRNA降解，于轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達(dá)進(jìn)行特異性調(diào)控[15]，具有操作簡單、可調(diào)控性強、靶向作用明顯、高效抑制靶基因表達(dá)等優(yōu)點，該技術(shù)有望成為治療疾

7、病的新手段[16]，為腫瘤治療提供了新的方法。
　　 本研究使用分子生物學(xué)手段檢測KLK7在胃癌細(xì)胞系、癌組織中的表達(dá)情況，分析該基因表達(dá)與胃癌臨床病理特征、疾病演進(jìn)的關(guān)系，體外構(gòu)建siRNA片段，并通過小分子干擾RNA技術(shù)初步探討KLK7沉默后對胃癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 [實驗方法]
　　 一、檢測人胃癌細(xì)胞系、胃癌及癌旁組織中KLK7表達(dá)
　　 應(yīng)用Westernblot方法研究11種人類胃癌細(xì)胞株

8、KLK7蛋白(hk7)的表達(dá)情況、GES-1細(xì)胞作為陰性對照。qRT-PCR法、Westernblot法檢測35例配對胃癌及相應(yīng)癌旁組織中KLK7mRNA及hk7蛋白表達(dá)差異。
　　 二、探討KLK7表達(dá)與胃癌臨床病理關(guān)系
　　 免疫組織化學(xué)法檢測192例胃癌組織KLK7表達(dá)。隨訪并完善臨床病理資料，分析KLK7表達(dá)與胃癌腫瘤類型的關(guān)系特點，統(tǒng)計分析KLK7與胃癌的預(yù)后關(guān)系。
　　 三、KLK7siRNA對胃癌A

9、GS細(xì)胞株增殖的影響
　　 利用ambion網(wǎng)站設(shè)計siRNA片段，體外構(gòu)建并合成四條KLK7siRNA，分別瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入胃癌AGS細(xì)胞株，qRT-PCR法、Westernblot法檢測KLK7表達(dá)變化，根據(jù)基因沉默效率進(jìn)行篩選、并確定其中一條siRNA作為后續(xù)研究使用。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl terazolium，MTT)法測定細(xì)胞增殖變化；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。
　　 四、

10、統(tǒng)計學(xué)處理：
　　 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組獨立數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗；兩樣本資料均數(shù)比較采用Wilcoxon；細(xì)胞周期及臨床病理因素組間差異的統(tǒng)計分析采用x2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗，多因素生存分析采用COX回歸分析。P值<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 一、檢測人胃癌細(xì)胞系及胃癌與癌旁組織中KLK7表達(dá)
　　 9種細(xì)胞株

11、Western blot檢測結(jié)果表明胃低分化腺癌細(xì)胞株hk7蛋白表達(dá)較其他細(xì)胞高，具有統(tǒng)計學(xué)差異；AGS細(xì)胞株中KLK7mRNA和hk7表達(dá)最高。qRT-PCR及Western blot法檢測證實胃癌組織中KLK7mRNA、hk7蛋白含量較癌旁組織表達(dá)明顯增高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、探討KLK7表達(dá)與胃癌臨床病理關(guān)系
　　 免疫組織化學(xué)法進(jìn)行基因表達(dá)及定位檢測：KLK7在胃癌組織中的表達(dá)率為70.833％，高于癌

12、旁組織46.875％放入表達(dá)率。該基因主要在低分化腺癌和印戒細(xì)胞癌中表達(dá)較高。腫瘤細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均有表達(dá)。癌旁組織、胃粘膜上皮組織KLK7表達(dá)較少，定位于細(xì)胞胞漿，而胞核中無表達(dá)。
　　 臨床病理資料統(tǒng)計結(jié)果顯示KLK7不表達(dá)患者中位生存時間74.717月，生存中位數(shù)75月，5年生存率63.2％；KLK7表達(dá)組中位生存時間58.214月，生存中位數(shù)為54月，5年生存率為37.9％；Log-Rank檢驗示x2值13.964，df

13、=1，P<0.05，K-M曲線顯示KLK7陽性表達(dá)與陰性表達(dá)對患者生存期的差別影響具有統(tǒng)計學(xué)意義；COX比例模型分析結(jié)果證實：腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、年齡、TNM、KLK7表達(dá)是獨立的胃癌預(yù)后因素。
　　 三、KLK7siRNA對AGS細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 熒光顯微鏡觀察顯示AGS細(xì)胞具有較好的轉(zhuǎn)染效率。利用瞬時轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)入四條KLK7siRNA，qRT-PCR法篩選各組轉(zhuǎn)染24h、48h后KLK7mR

14、NA水平變化，596siRNA對KLK724h抑制率為49.30％±0.86，48h抑制率為17.07％±1.07％，較對照組mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；416siRNA組24h抑制率：77±1.02％、48h抑制率：23.69±1.53％，其余兩組未見明顯改變，Western blot進(jìn)一步證實416siRNA能較好沉默hk7蛋白表達(dá)，故選擇416siRNA組進(jìn)行后續(xù)試驗。
　　 MTT法檢測416KLK7siRNA

15、對AGS細(xì)胞增殖影響，AGS生長24h增殖抑制不明顯、48h為22.12％、72h為39.88％，流式細(xì)胞術(shù)檢測416KLK7siRNA轉(zhuǎn)染48h后AGS細(xì)胞周期及凋亡變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，比例55.94±2.01，與對照組49.58±1.24相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時NC組與416KLK7siRNA組均未見細(xì)胞周期前的凋亡峰，考慮對細(xì)胞凋亡影響不明顯。
　　 [結(jié)論]
　　 1、胃癌細(xì)胞和癌組織中KL