灰葡萄孢BcKMO基因對病菌生長發(fā)育和致病力的影響.pdf

1、通過篩選灰葡萄孢ATMT突變體庫，從中獲得了一株致病力增強的突變體BCG183，通過對該突變體的致病力和表型進行分析，發(fā)現(xiàn)該突變體致病力增強，在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢，不產(chǎn)生分生孢子和菌核，菌絲較野生型變細，明確了其突變基因為BcKMO，為了進一步證實該突變基因在灰葡萄孢菌絲生長、分生孢子及菌核產(chǎn)生、致病過程中的作用，我們利用生物信息學方法，對突變基因及其編碼產(chǎn)物進行了分析;利用PEG介導的原生質體轉化方法，在BcKMO基因T-DN

2、A插入突變體(BCG183)的基礎上，創(chuàng)制了該基因的回復突變體(BCG183/BcKMO)。對野生型、突變體BCG183和回復突變體BCG183/BcKMO的菌落、菌絲形態(tài)、生長速度、分生孢子產(chǎn)量、致病能力和主要的致病因子（胞壁降解酶活性、毒素致病能力、致病相關基因表達水平等）進行了比較研究，主要結果如下:
　　1.BcKMO，基因全長1221 bp，無內含子，編碼406個氨基酸的犬尿氨酸單氧酶(kynurenine3-monoo

3、xygenase，KMO)，含有單氧酶FAD的保守結構域和4個類似芳香環(huán)羥化酶基序，具有NADPH氧化酶活性。系統(tǒng)發(fā)育結果表明BcKMO與核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的gi563295659和從線嘴殼（Ophiostoma piceae）的gi512192943基因親緣關系較近。
　　2.突變體BCG183在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，不產(chǎn)生分生孢子和菌核，菌絲較野生型變細且致密;而野生型和回復突變體BC

4、G183/BcKMO生長速度基本一致，均能產(chǎn)生分生孢子和菌核;突變體BCG183在蕓豆葉片和黃瓜葉片上的致病力明顯高于野生型和回復突變體。
　　3.突變體BCG183產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性均較野生型和回復突變體（BCG183/BcKMO）明顯增強，但纖維素酶(Cx)、果膠甲基反式消除酶(PMGE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)活性與野生型和回復突變體沒有明顯差別;突變體BCG183

5、的毒素活性較野生型和回復突變體明顯增強;突變體BCG183的產(chǎn)酸能力較野生型和回復突變體（BCG183/BcKMO）明顯減弱;野生型、突變體BCG183和回復突變體BCG183/BcKMO均能穿透洋蔥表皮。
　　4.利用Real-Time PCR技術檢測野生型、突變體BCG183、回復突變體BCG183/BcKMO中致病相關基因（bac、bcg2、bcg3、PkaR、bmp1、Sak1、bcreg1、bos1、bcp1、Ras2、