巰基、甲基供體及天然抗氧化物對砷代謝及其所致氧化損傷的研究.pdf

1、前言：
　　無機(jī)砷化物慢性暴露可造成包括神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌和呼吸系統(tǒng)在內(nèi)的全身性損傷以及典型的皮膚損害，并引發(fā)多器官癌癥，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)NRC2007年統(tǒng)計，全球約有2億人因長期飲用被無機(jī)砷化物天然污染的高砷地下水而面臨健康威脅。時至今日，飲水型砷中毒依然是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。中國是世界上受飲水型砷中毒危害最嚴(yán)重的國家之一，據(jù)2013年本研究組發(fā)表在《科學(xué)》上的一項研究結(jié)果顯示，我國的砷污染區(qū)面積約多達(dá)58萬平方公里，

2、結(jié)合人口分布，預(yù)測我國約有1958萬人受到高砷飲用水的危害。因此，長期飲用高砷水對人類健康的危害受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。
　　隨著在砷代謝模式研究上的重大突破，人們逐漸意識到砷代謝模式和致病機(jī)制關(guān)系密切。目前已清楚，無機(jī)砷(iAs)進(jìn)入體內(nèi)后，在巰基供體谷胱甘肽(GSH)和甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的存在下經(jīng)過兩次氧化甲基化和還原過程，生成多種不同形態(tài)和價態(tài)的砷化物。進(jìn)入體內(nèi)的砷及其代謝產(chǎn)物主要通過尿液排出體外。大量流

3、行病學(xué)調(diào)查證實，尿液中iAs和MMA越多，DMA越少，表明機(jī)體砷甲基化或砷代謝能力越低，其發(fā)病風(fēng)險越大，病情越重。
　　我國內(nèi)蒙古高砷污染區(qū)的大樣本人群研究顯示，高砷暴露人群個體的砷代謝模式呈現(xiàn)多樣性。而目前學(xué)者們普遍認(rèn)為遺傳因素和外源性因素是造成人群砷代謝模式多樣性的主要原因。我們對內(nèi)蒙古某一高砷暴露人群兩年前后的砷代謝模式比較研究顯示，研究人群每個個體不同時間點的砷甲基化能力和代謝模式發(fā)生了顯著變化。這一結(jié)果充分說明，在砷代謝

4、和中毒發(fā)病過程中，雖然遺傳因素起作用，但外源性因素起著更主要的作用。探索外源性因素對砷代謝和毒性影響對砷中毒發(fā)生和預(yù)防可能更為重要。另外我們通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，外源性給予葉酸干預(yù)可以增強Chang肝細(xì)胞的砷甲基化能力，拮抗砷所致的氧化損傷。由此可見，膳食中所含的某些營養(yǎng)素可能直接或間接參與到砷甲基化的過程，從而影響砷代謝。
　　氧化應(yīng)激學(xué)說是砷中毒發(fā)病機(jī)制的重要理論之一。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示個體甲基化能力的差別能夠通過影響機(jī)體的氧化

5、應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致人群砷中毒易感性的差異。機(jī)體具有一系列復(fù)雜的抗氧化防御體系。其中Nrf2-ARE信號通路是其中最重要的一部分。該通路最終通過調(diào)控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)來降低機(jī)體對氧化應(yīng)激的敏感性，從而阻止相關(guān)疾病的發(fā)生。而近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，這一信號傳導(dǎo)通路可以被某些抗氧化物質(zhì)活化，其中尤以十字花科蔬菜等天然食品中所含有的萊菔硫烷(SFN)具有誘發(fā)Nrf2的作用倍受關(guān)注。
　　基于以上理論分析，本研究即采用動物實驗

6、與人群干預(yù)實驗相結(jié)合的方法，以影響砷代謝的巰基供體谷胱甘肽(GSH)，甲基供體同型半胱氨酸(Hcy)和誘導(dǎo)Nrf2信號通路表達(dá)的天然物質(zhì)（西蘭花粉）為切入點，來探討上述干預(yù)物質(zhì)對砷甲基化代謝模式和砷所致的氧化損傷的影響，并試圖為使用外源性化合物來對抗或緩解砷誘導(dǎo)的慢性損傷的可能性和可行性等提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、研究對象
　　(1)巰基供體(GSH)對飲水砷暴露小鼠砷代謝模式及氧化損傷的影響選擇健康、清潔級

7、昆明種雌性小鼠72只，體重(25±2.0)克，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分成對照組、單純?nèi)旧榻M，200、400和800 mg/kg體重的GSH腹腔注射干預(yù)組和600 mg/kg體重的BSO腹腔注射干預(yù)組，每組12只。對照組鼠飲用蒸餾水，其余各組小鼠均自由飲用含砷50 mg/L的亞砷酸鈉(NaAsO2)水溶液至實驗結(jié)束。又分為短期染毒和長期染毒兩個亞組，分別為染毒10天和30周。GSH和BSO干預(yù)組染毒結(jié)束前兩日各組給予不同的干預(yù)措施。

8、
　　(2)甲基供體(Hcy)對飲水砷暴露小鼠砷代謝模式及氧化損傷的影響選擇健康、清潔級昆明種雌性小鼠36只，體重(25±2.0)克，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為對照組、單純?nèi)旧榻M和Hcy腹腔注射干預(yù)組，每組12只小鼠。對照組鼠飲蒸餾水，其余各組小鼠均自由飲用含砷50 mg/L的NaAsO2水溶液至實驗結(jié)束。又按干預(yù)時間分為兩個亞組，即Hcy干預(yù)一天組和Hcy干預(yù)一周組。
　　(3)西蘭花粉對模擬砷暴露人群砷代謝模式的影

9、響
　　選擇健康志愿者共32人，其中男女各16人，身體健康。對照組10人（只服用西蘭花粉），牛黃解毒片組6人（只服用牛黃解毒片），牛黃解毒片加西蘭花組6人（服用牛黃解毒片和西蘭花），海苔組6人（只服用海苔），海苔加西蘭花組6人（服用海苔和西蘭花）。所有受試對象禁食海產(chǎn)品三天后采清晨尿樣10 ml并按組別服用相應(yīng)食品或藥品。牛黃解毒片組和牛黃解毒片加西蘭花組服用牛黃解毒片，每次兩片，早晚各一次，共服四片;海苔組和海苔加西蘭花組一次性

10、食用海苔20 g;牛黃解毒片加西蘭花組與海苔加西蘭花組在服用牛黃解毒片和海苔后當(dāng)晚即用200ml室溫飲用水與5 g西蘭花粉配制成飲品飲用;對照組于同時飲用同樣的飲品。服用牛黃解毒片和海苔僅在實驗開始前一天進(jìn)行，西蘭花粉在實驗開始后每天飲用。實驗員監(jiān)督受試對象按要求進(jìn)食相應(yīng)藥物，并分別于實驗開始后第一、二、四、七、十和十四天采當(dāng)日晨尿10 ml。本部分研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批通過。
　　2、指標(biāo)測定與方法
　　(1)尿

11、、肝臟和腎臟中各形態(tài)砷含量的測定:氫化物發(fā)生-超低溫捕集-原子吸收分光光度計法。
　　(2)尿肌酐(Cr)含量測定:苦味酸法
　　(3)全血、肝臟和腎臟GSH含量的測定:DTNB法
　　(4)血清、肝臟和腎臟總抗氧化能力(T-AOC)的測定:比色法
　　(5)肝臟MDA含量測定:TBA法
　　(6)肝臟和腎臟蛋白含量測定:雙縮脲法
　　3、統(tǒng)計分析
　　實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

12、多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(SNK)。采用t檢驗比較2組間數(shù)值變量是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1、巰基供體(GSH)對砷暴露小鼠一般狀態(tài)，砷甲基化能力和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　(1)亞急性砷暴露實驗
　　所有小鼠用NaAsO2處理過程中均存活。不同組別小鼠體重、飲水量和腎臟臟器系數(shù)間均無顯著差異，染砷組及iAs+BSO

13、干預(yù)組小鼠肝臟臟器系數(shù)顯著高于對照組。
　　各染砷組小鼠尿液、肝臟和腎臟中各形態(tài)砷及總砷含量均比對照組有顯著升高。與單純?nèi)旧榻M比較，GSH干預(yù)組尿砷的排出量和腎臟中砷的蓄積量顯著增加而肝臟中砷的蓄積量顯著減少。與GSH干預(yù)組相反，BSO干預(yù)組尿砷的排出量和腎臟中砷的蓄積量顯著減少但肝臟中砷的蓄積量顯著增加。與單純?nèi)旧榻M比較，GSH干預(yù)組尿中iAs％顯著減少，F(xiàn)MR顯著增加，而BSO干預(yù)組尿中iAs％和MMA％顯著增加，DMA％、F

14、MR和SMR均顯著下降;800 mg/kg GSH干預(yù)組肝臟MMA％減少，DMA％、FMR和SMR均顯著升高;GSH干預(yù)組小鼠腎臟iAs％顯著低于單純?nèi)旧榻M，DMA％、FMR和SMR均顯著升高，而BSO干預(yù)組出現(xiàn)的情況與GSH干預(yù)組相反，與單純?nèi)旧榻M相比，iAs％顯著升高，MMA％、DMA％、FMR和SMR水平顯著降低。
　　與對照組相比，染砷會顯著降低血液、肝臟和腎臟中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平，而給予一定劑量的GS

15、H可以有效拮抗砷引起的以上指標(biāo)的變化。與單純?nèi)旧榻M相比，BSO干預(yù)顯著降低血液，肝臟和腎臟中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平。
　　(2)慢性砷暴露實驗
　　所有小鼠用NaAsO2處理過程中均存活。不同組別小鼠體重、飲水量、肝臟和腎臟臟器系數(shù)間均無顯著差異。
　　各染砷組小鼠尿液、肝臟和腎臟中各形態(tài)砷及總砷含量均比對照組有顯著升高。與單純?nèi)旧榻M比較，各劑量GSH干預(yù)組尿砷的排出量顯著增加，腎臟中砷的蓄積量顯著增加

16、但肝臟中砷的蓄積量顯著減少。與GSH干預(yù)組相反，BSO干預(yù)組尿砷的排出量顯著減少，腎臟中砷的蓄積量顯著減少但肝臟中砷的蓄積量顯著增加。與單純?nèi)旧榻M比較，GSH干預(yù)組尿中MMA％顯著減少，DMA％和SMR顯著增加，而BSO干預(yù)組尿中iAs％和MMA％顯著增加，DMA％顯著減少，F(xiàn)MR和SMR均顯著下降;800 mg/kg GSH干預(yù)組肝臟iAs％、MMA％顯著下降，DMA％顯著增加，F(xiàn)MR和SMR均顯著升高;GSH干預(yù)組小鼠腎臟iAs％顯

17、著低于單純?nèi)旧榻M，DMA％、FMR和SMR均顯著升高，而BSO干預(yù)組出現(xiàn)的情況與GSH干預(yù)組相反，與單純?nèi)旧榻M相比，iAs％、MMA％顯著升高，DMA％、FMR和SMR水平顯著降低。
　　與對照組相比，染砷會顯著降低血液、肝臟和腎臟中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平，而給予一定劑量的GSH可以有效拮抗砷引起的以上指標(biāo)的變化。與單純?nèi)旧榻M相比，BSO干預(yù)顯著降低血液，肝臟和腎臟中GSH和T-AOC水平，增加MDA水平。

18、　　2、甲基供體(Hcy)干預(yù)對砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　(1)Hcy干預(yù)一天對砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　單純?nèi)旧榻M和Hcy干預(yù)組小鼠尿中各形態(tài)砷及總砷含量均高于對照組，Hcy干預(yù)組小鼠尿中DMA和TAs含量均顯著高于單純?nèi)旧榻M，而Hcy干預(yù)組小鼠尿中MMA％顯著低于單純?nèi)旧榻M而SMR顯著高于單純?nèi)旧榻M。與單純?nèi)旧榻M相比，Hcy干預(yù)組小鼠肝臟iAs、TAs含量和iAs％均顯著降低，

19、DMA％、FMR和SMR顯著增加;Hcy干預(yù)組小鼠腎臟iAs含量和iAs％顯著降低，而DMA％和FMR顯著增加。
　　單純?nèi)旧榻M小鼠全血和肝臟GSH含量顯著低于對照組，Hcy干預(yù)組小鼠肝臟GSH含量高于單純?nèi)旧榻M，腎臟GSH含量各組之間沒有顯著性差異。單純?nèi)旧榻M小鼠血清T-AOC顯著低于對照組，Hcy干預(yù)組小鼠血清T-AOC較單純?nèi)旧榻M無顯著性變化，小鼠肝臟T-AOC在單純?nèi)旧榻M和Hcy干預(yù)組兩組之間沒有差異，但均顯著低于對照組，

20、Hcy干預(yù)組小鼠腎臟T-AOC顯著低于對照組和單純?nèi)旧榻M。
　　(2)Hcy干預(yù)一周對砷暴露小鼠砷甲基化能力和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　與對照組相比，單純?nèi)旧榻M和Hcy干預(yù)組小鼠尿中各形態(tài)砷及總砷含量顯著升高，Hcy干預(yù)組小鼠尿中MMA、DMA和TAs含量顯著低于單純?nèi)旧榻M，而各形態(tài)砷百分比和甲基化率與單純?nèi)旧榻M無顯著性差異。染砷干預(yù)組與單純?nèi)旧榻M比較，小鼠肝臟中DMA和TAs含量顯著高于單純?nèi)旧榻M，而各形態(tài)砷百分比和甲基化率

21、的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Hcy干預(yù)組腎臟各iAs、DMA和TAs含量均高于單純?nèi)旧榻M，SMR高于單純?nèi)旧榻M，但各形態(tài)砷百分比和FMR比較沒有差異。
　　單純?nèi)旧榻M小鼠全血、肝臟和腎臟GSH水平均低于對照組和Hcy干預(yù)組。Hcy干預(yù)組小鼠肝臟GSH水平也顯著低于對照組。與單純?nèi)旧榻M相比，Hcy干預(yù)組小鼠全血、肝臟和腎臟GSH水平均升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。單純?nèi)旧榻M小鼠血清T-AOC顯著低于對照組，而Hcy干預(yù)組血清T-AOC顯著高于

22、單純?nèi)旧榻M，Hcy干預(yù)組小鼠肝臟T-AOC顯著高于單純?nèi)旧榻M，Hcy干預(yù)組小鼠腎臟T-AOC顯著低于對照組和單純?nèi)旧榻M。
　　3、西蘭花粉對人體尿砷甲基化代謝模式的影響
　　(1)西蘭花粉對服用牛黃解毒片人群砷代謝模式的影響
　　牛黃解毒片組人群尿各形態(tài)砷及總砷含量均顯著高于對照組，且在服藥后第一天達(dá)到高峰，之后逐漸降低。在第7天后尿中各形態(tài)砷及總砷與對照組已沒有顯著差異。服藥后第一天牛黃解毒片加西蘭花組尿各形態(tài)砷及總

23、砷含量均顯著高于牛黃解毒片組。服藥后第二天牛黃解毒片加西蘭花組尿MMA、DMA及TAs均顯著高于牛黃解毒片組。服藥后第四天及以后各時間點尿中總砷和各形態(tài)砷與牛黃解毒片組相比未見顯著性差異。
　　服藥后第一天牛黃解毒片組和牛黃解毒片加西蘭花組人群尿iAs％和MMA％均顯著高于對照組，而DMA％、FMR及SMR均顯著低于對照組;染砷后第一天牛黃解毒片加西蘭花組尿各形態(tài)砷及總砷均顯著高于牛黃解毒片組，而牛黃解毒片組和牛黃解毒片加西蘭花組

24、尿各形態(tài)砷百分比及甲基化率未見顯著差異。服藥后第二天及以后各時間點各組尿中各形態(tài)砷百分比及甲基化率無顯著性差異。
　　(2)西蘭花粉對食用海苔人群砷代謝模式的影響
　　食用海苔前各組尿各形態(tài)砷及總砷含量未見顯著差異。食用海苔后尿中iAs和MMA的量與對照組相比沒有顯著變化。食用海苔后第一、二和四天海苔組和海苔加西蘭花組人群尿DMA和總砷含量均顯著高于對照組，且在食用海苔后第二天達(dá)到高峰。在第7天后尿DMA和總砷含量與對照組已

25、沒有顯著差異。食用海苔后第二天食用海苔加西蘭花組尿DMA及總砷均顯著高于海苔組。食用海苔后第四天以后各時間點各組尿中總砷和各形態(tài)砷間未見顯著性差異。
　　食用海苔前各組尿各形態(tài)砷百分比及甲基化率未見顯著差異。食用海苔后第二天海苔組和海苔加西蘭花組人群尿MMA％顯著低于對照組，而DMA％和SMR均顯著高于對照組;而海苔組和海苔加西蘭花組比較尿各形態(tài)砷百分比及甲基化率未見顯著差異。食用海苔后第四天及以后各時間點各組尿中各形態(tài)砷百分比及

26、甲基化率與對照組相比未見顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1、外源性GSH干預(yù)可以增強砷暴露小鼠的砷甲基化能力，增加砷從尿液中的排出，減少砷在體內(nèi)的蓄積，從而降低了砷對機(jī)體的毒性損傷。
　　2、外源性GSH干預(yù)可以拮抗砷所致的GSH和T-AOC水平下降，從而減少了砷對機(jī)體造成的氧化損傷。
　　3、給予BSO耗竭GSH后所產(chǎn)生的效應(yīng)與GSH干預(yù)相反，更加證明了GSH在砷代謝中的重要性。
　　4、對砷暴露小鼠進(jìn)行一