黃瓜耐熱性及熱脅迫響應(yīng)基因研究.pdf

1、高溫是作物生長過程中經(jīng)常遇到的逆境脅迫，其造成的熱害已成為黃瓜夏季栽培與保護(hù)地栽培的主要限制因子。如何提高黃瓜耐熱性是目前黃瓜育種研究的重要內(nèi)容之一。正確理解黃瓜的耐熱機(jī)制則是耐熱育種的基礎(chǔ)。本文從生理指標(biāo)和分子生物學(xué)等方面對(duì)黃瓜耐熱性進(jìn)行了研究，以期更加深刻地理解黃瓜耐熱機(jī)制，為黃瓜耐熱育種打下基礎(chǔ)。主要作了以下研究： 1.黃瓜熱害癥狀研究及耐熱材料篩選 以耐熱品種‘Poinsett 97’和熱敏品種‘Boothbyl

2、s Blonde’為試驗(yàn)材料，采用42℃高溫處理黃瓜幼苗24h，觀察子葉、幼葉、心葉、下胚軸及整株幼苗的熱害癥狀，并記載熱處理后不同時(shí)間的熱害癥狀變化。提出了明確的黃瓜幼苗熱害癥狀的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于田間熱害的診斷及黃瓜耐熱性的鑒定與評(píng)價(jià)具有良好的實(shí)用價(jià)值。 將不同類型黃瓜品種的種子置于28℃、38℃和42℃溫度下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，比較種子的發(fā)芽能力。結(jié)果表明：不同類型的黃瓜品種在不同的溫度下發(fā)芽能力存在明顯差異，其中西雙版納黃瓜、‘P

3、oinsett 97’、‘北京截頭’種子發(fā)芽耐熱能力明顯強(qiáng)于‘HHl—8-57’和‘二早子’。 以所收集的不同生態(tài)型的黃瓜品種為試驗(yàn)材料，經(jīng)田問自然高溫幼苗期與成株期耐熱性篩選，結(jié)合人工高溫幼苗耐熱性比較。結(jié)果獲得耐熱黃瓜品種材料5個(gè)，熱敏黃瓜品種材料2個(gè)。豐富了黃瓜耐熱性與熱害研究的材料，有助于解決黃瓜生產(chǎn)中的熱害問題。 2.黃瓜耐熱生理指標(biāo)研究 以黃瓜耐熱品種‘Poinsett 97’、熱敏品種‘Boothb

4、yls Blonde’和它們雜交的F<,1>為實(shí)驗(yàn)材料，研究黃瓜幼苗在28℃和38℃下，葉片中保護(hù)性酶類活性和膜透性的變化。結(jié)果表明：在38℃熱脅迫下，耐熱品種的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量提高量明顯低于熱敏品種，而其保護(hù)酶SOD、POD活性和PRO含量的提高明顯高于熱敏品種，CAT活性的降低量明顯低于熱敏品種。在熱脅迫下，F(xiàn)<,1>的POD活性表現(xiàn)正向雜種優(yōu)勢(shì)，其余均為負(fù)向優(yōu)勢(shì)。 3.黃瓜熱脅迫響應(yīng)基因分離和分子標(biāo)記篩選 為

5、了快速高效地提取黃瓜幼葉總RNA，滿足于cDNA-AFLP實(shí)驗(yàn)的要求。對(duì)Trizol試劑提取總RNA的方法進(jìn)行了改進(jìn)，所提RNA經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，其28S、18S、5S三條帶清晰，完整性好，每0.1g幼葉可獲得RNA109～150μg，產(chǎn)率高。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、雙鏈cDNA合成和cDNA-AFLP檢測(cè)，證實(shí)提取的RNA完全能達(dá)到cDNA-AFLP對(duì)RNA的要求。以耐熱品種‘西雙版納黃瓜’和熱敏品種‘二早子’為供試材料，對(duì)幼苗進(jìn)行38℃熱激處理2

6、h。采用cDNA-AFLP技術(shù)比較熱激前后基因表達(dá)差異，分離黃瓜熱激響應(yīng)基因。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)所分離基因的表達(dá)。從‘二早子’中分離到chrr182特異片段，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該片段與轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子(TRCF)同源。該基因在38℃下被誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)。表明黃瓜幼苗耐熱性或熱傷害的發(fā)生可能與TRCF基因的響應(yīng)有關(guān)。 用耐熱自交系‘Poinsett 97’和熱敏自交系‘Boothbyls Blonde’經(jīng)雜交和自交構(gòu)建F<,2>分離群體

7、，利用分離群體分組分析方法先找到與耐熱性狀相關(guān)的候選SSR標(biāo)記，然后在群體中進(jìn)行驗(yàn)證。篩選到CMCT505的SSR標(biāo)記與黃瓜耐熱性狀相關(guān)，Mapmaker分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記的連鎖距離為：19.3cM。本研究篩選到與黃瓜耐熱相關(guān)的SSR分子標(biāo)記1個(gè)，為黃瓜耐熱品種選育奠定了基礎(chǔ)。 4.黃瓜CSHSP70基因克隆、表達(dá)及其內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析 以耐熱品種‘西雙版納黃瓜’和熱敏品種‘二早子’為供試材料，用25℃、38℃和42℃處理幼苗2

8、h。根據(jù)黃瓜CSHSP70基因cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)黃瓜CSHSP70基因的表達(dá)。在25℃下，耐熱品種‘西雙版納黃瓜’和熱敏品種‘二早子’CSHSP70基因表達(dá)量難以檢測(cè)到；在高溫?zé)崦{迫下，該基因能明顯增強(qiáng)表達(dá)，但兩類品種CSHSP70基因的表達(dá)存在差異，其中熱敏品種‘二早子’在38℃下增強(qiáng)表達(dá)明顯，而耐熱品種‘西雙版納黃瓜’則在42℃下才明顯增強(qiáng)表達(dá)。黃瓜CSHSP70基因在熱脅迫下增強(qiáng)表達(dá)，這有助于理解黃

9、瓜熱害與耐熱性的分子機(jī)理。 內(nèi)含子廣泛存在于真核生物基因組非編碼蛋白的DNA序列中，能夠有效地調(diào)控基因表達(dá)。為了探明黃瓜CSHSP70基因的內(nèi)含子數(shù)目及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。根據(jù)黃瓜CSHSP70基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從gDNA中克隆CSHSP70基因，采用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證內(nèi)含子的存在。經(jīng)測(cè)序與拼接，得到長度為4056bp的黃瓜CSHSP70基因，它包含7個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)含子富含A·T，具有類似啟動(dòng)子和HS