利用SpliT-Intein內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白功能恢復(fù)創(chuàng)建雙組分雄性不育系的研究.pdf

1、目前盡管通過(guò)基因工程手段已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞核不育，但得到的不育系與相應(yīng)保持系雜交后僅能得到50％的不育株，其余50％的可育株需要去除。如何獲得不育率為100％的核不育系是目前雄性不育研究的重點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本研究將毒蛋白基因Barnase和草甘膦抗性基因G2-EPSPS分拆為無(wú)活性的N端和C端兩個(gè)片段并分別與Ssp DnaE內(nèi)含肽和Npu DnaE內(nèi)含肽的N端和C端融合，分別構(gòu)建pCABarESN、pCABarESC、pCABarS

2、NZESN、pCABarSCZESC植物表達(dá)載體以及pCABarESP、pCABarABn兩個(gè)對(duì)照載體。分別將其導(dǎo)入芥菜和甘藍(lán)植株，研究利用Split-Intein內(nèi)含肽介導(dǎo)分拆蛋白結(jié)構(gòu)和功能重建實(shí)現(xiàn)100％雄性不育的可行性。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴芥菜中實(shí)現(xiàn)了Npu DnaE內(nèi)含肽介導(dǎo)split-EPSPS基因功能重建。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pCABarESN、pCABarESC載體以及對(duì)照載體pCABarESP分別轉(zhuǎn)化芥菜，

3、獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因芥菜植株。經(jīng)PCR，RT-PCR分析結(jié)果顯示ESN、ESC、G2-EPSPS基因已轉(zhuǎn)入芥菜植株并表達(dá)。PPT抗性篩選結(jié)果顯示，部分pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因植株中的ESN、ESC基因?yàn)槎鄠€(gè)位點(diǎn)插入芥菜基因組。草甘膦抗性篩選結(jié)果表明，僅表達(dá)G2-EPSPS基因N端和C端片段的pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因芥菜植株不具有草甘膦抗性，表達(dá)G2-EPSPS基因完整序列的pCABarESP轉(zhuǎn)基因芥菜

4、植株具有草甘膦抗性。而pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因芥菜植株雜交后代因Npu DnaE內(nèi)含肽的介導(dǎo)的G2-EPSPS蛋白結(jié)構(gòu)和功能重建，植物具有草甘膦抗性。
　?、偏@得了芥菜雙組分雄性不育親本植株。將pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入芥菜植株，獲得具有PPT抗性的芥菜植株雙組分雄性不育親本植株，經(jīng)PCR檢測(cè)目的基因已整合到芥菜基因組中。
　　⑶獲得了轉(zhuǎn)基因雄性不育甘藍(lán)植株。BcA

5、9驅(qū)動(dòng)下的核糖核酸酶Barnase基因植物表達(dá)載體pCABarABn，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化導(dǎo)入甘藍(lán)材料‘TF’，獲得具有除草劑Basta抗性的甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株。細(xì)胞學(xué)觀(guān)察顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的花藥因絨氈層細(xì)胞提前降解，花粉母細(xì)胞退化，成熟花藥中無(wú)正常花粉粒產(chǎn)生。相對(duì)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨D(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株花器官變小，花瓣褶皺多，柱頭彎曲，雄蕊瘦小等現(xiàn)象。另外，轉(zhuǎn)基因植株在溫度低于22℃時(shí)出現(xiàn)明顯的死蕾現(xiàn)象，當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，死蕾現(xiàn)象得到緩解。

6、田間結(jié)實(shí)情況調(diào)查顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株自交不能結(jié)實(shí)，與野生型雜交可結(jié)實(shí)但種莢變短。
　?、全@得了甘藍(lán)雙組分雄性不育親本植株。將pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株，獲得具有PPT抗性的甘藍(lán)雙組分雄性不育親本植株，經(jīng)PCR檢測(cè)目的基因已整合到甘藍(lán)基因組中，RT-PCR分析結(jié)果顯示，ESN、ESC基因在pCABarSNZESN、pCABarSCZESC轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)葉片中正常表達(dá);SN、SC基因在pCA