鄰羥基苯甲酸脅迫對不同杉木無性系化感效應(yīng)及差異蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、植物化感作用是指植物通過向環(huán)境釋放特定的次生物質(zhì)從而對鄰近其它植物生長發(fā)育產(chǎn)生的有益或有害影響。自毒作用是化感作用的一種特殊表現(xiàn)形式，它廣泛存在于自然界的許多物種中。自毒作用，就是植物的葉、根等器官通過分泌、淋溶、腐解等方式向環(huán)境中釋放自毒物質(zhì)，當(dāng)自毒物質(zhì)在土壤中積累到一定程度后會(huì)導(dǎo)致逆境脅迫，引起植株生理代謝調(diào)節(jié)能力下降，對同種植物種子萌發(fā)和生長起抑制作用的現(xiàn)象。 杉木連栽引起的自毒作用已被國內(nèi)學(xué)者所證實(shí)，自毒物質(zhì)的積累可導(dǎo)致

2、杉木林地力衰退、生產(chǎn)力下降。鄰羥基苯甲酸是杉木酚酸類自毒物質(zhì)之一。本研究通過向MS培養(yǎng)基添加此種酚酸進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，并以篩選出的忍耐型和敏感型2種杉木無性系組培苗為試驗(yàn)材料，研究鄰羥基苯甲酸脅迫對2個(gè)不同抗性杉木無性系葉片的滲透調(diào)節(jié)因子、抗氧化酶系統(tǒng)、核酸與蛋白質(zhì)、內(nèi)源激素若干生理過程的化感效應(yīng)，并對鄰羥基苯甲酸脅迫下2個(gè)無性系葉片的差異蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下： 1．鄰羥基苯甲酸脅迫對不同杉木無性系葉片滲透調(diào)節(jié)因子的化

3、感效應(yīng) 低濃度鄰羥基苯甲酸脅迫在脅迫前期膜脂過氧化表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，隨著脅迫時(shí)間的延長和脅迫濃度的增大，鄰羥基苯甲酸對膜脂過氧化的促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)，01號表現(xiàn)出的促進(jìn)效應(yīng)比02號弱，MDA的積累速度也相對較慢。質(zhì)膜透性的化感效應(yīng)在脅迫前期多表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，但01號在40mg/L脅迫濃度下表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，隨著脅迫時(shí)間延長，2個(gè)無性系的促進(jìn)效應(yīng)下降，但到脅迫后期，促進(jìn)效應(yīng)大幅度提高，02號杉木無性系質(zhì)膜透性在各濃度脅迫下的促進(jìn)效應(yīng)均比01

4、號高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重。01號杉木無性系的可溶性糖含量表現(xiàn)的促進(jìn)效應(yīng)比02號來得更早，效應(yīng)指數(shù)也大于02號，而且在高濃度脅迫下表現(xiàn)出的抑制效應(yīng)卻比02號小。整個(gè)脅迫過程中杉木葉片總游離氨基酸含量均表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，總體上01號的促進(jìn)效應(yīng)大于02號，脅迫后期在40mg/L、80mg/L、120mg/L脅迫濃度下其促進(jìn)效應(yīng)指數(shù)已分別達(dá)到02號的4、8、3倍。脯氨酸的積累對鄰羥基苯甲酸脅迫的響應(yīng)不敏感。 2．鄰羥基苯甲酸脅迫對不同杉木

5、無性系葉片抗氧化酶活性的化感效應(yīng) 各脅迫濃度對SOD活性的化感效應(yīng)在脅迫初期、中期表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，脅迫后期轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩?yīng)；2個(gè)無性系SOD活性化感效應(yīng)的差異主要從脅迫中期開始，02號SOD活性促進(jìn)效應(yīng)大幅度下降，并在高濃度脅迫下化感效應(yīng)為0，而01號依然保持促進(jìn)效應(yīng)；脅迫后期出現(xiàn)抑制效應(yīng)時(shí)，01號的抑制效應(yīng)又低于02號。 2個(gè)無性系葉片POD活性的化感效應(yīng)在均表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，脅迫第10天、20天時(shí)，各脅迫濃度對01號PO

6、D活性的促進(jìn)效應(yīng)明顯大于02號，而在第30天時(shí)則是02號的促進(jìn)效應(yīng)更強(qiáng)，表明01號無性系葉片POD參與清除H<,2>O<,2>的時(shí)期更早。脅迫初期，2個(gè)無性系葉片CAT活性均表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，對01號的促進(jìn)作用大于02號。到了脅迫后期，對01號CAT活性仍然保持促進(jìn)作用，但脅迫濃度越大，促進(jìn)作用越小，而對02號則產(chǎn)生了抑制作用，脅迫濃度越大，抑制作用越大。 AsA-POD化感效應(yīng)均表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)。脅迫初期，01號無性系迅速啟動(dòng)了A

7、sA-POD清除H<,2>O<,2>的功能，在各脅迫濃度下表現(xiàn)出的促進(jìn)作用均大于02號，雖然02號在脅迫中期時(shí)的促進(jìn)效應(yīng)強(qiáng)于01號，但差異不大，而到了脅迫后期，01號AsA-POD活性的促進(jìn)效應(yīng)有所回升，而02號則發(fā)生大幅度下降。 01號的PPO活性在脅迫下均表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，而02號則隨脅迫延長表現(xiàn)為抑制一促進(jìn)一抑制的變化特點(diǎn)，表明01號啟動(dòng)了PPO抗氧化的功能，積極參與了植物抵御不良環(huán)境的過程，而02號PPO參與氧化物清除的時(shí)

8、期晚于01號，并且只是暫時(shí)性的。 3．鄰羥基苯甲酸脅迫對不同杉木無性系葉片蛋白質(zhì)及核酸含量的化感效應(yīng) 鄰羥基苯甲酸脅迫對01號DNA合成多表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，而02號多表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，01號RNA合成多表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，而對02號多表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，可見鄰羥基苯甲酸脅迫對不同無性系核酸的作用機(jī)制不同，對01號無性系核酸的化感作用主要體現(xiàn)在RNA的合成與分解機(jī)制，而對02號則主要影響DNA的合成與分解機(jī)制。 在脅迫初期各脅

9、迫濃度對02號蛋白質(zhì)含量的促進(jìn)效應(yīng)大于01號，但在脅迫中后期，02號的促進(jìn)效應(yīng)呈下降趨勢，01號的促進(jìn)效應(yīng)隨脅迫濃度加大而不斷增大，蛋白質(zhì)合成能力不斷提高，并超過02號。隨著脅迫強(qiáng)度增大，01號可能有更多的蛋白質(zhì)參與了對此種脅迫的響應(yīng)，從而提高了抗逆性。 4．鄰羥基苯甲酸脅迫對不同杉木無性系葉片內(nèi)源激素含量的化感效應(yīng) 從總體上看，鄰羥基苯甲酸脅迫下對ABA含量表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)， 01號的促進(jìn)效應(yīng)大于02號；IAA、GA<,

10、3>、ZR含量表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，對01號GA<,3>、ZR含量的抑制效應(yīng)比02號強(qiáng)，但2個(gè)無性系間IAA含量的抑制效應(yīng)差異不顯著，在脅迫第30天時(shí)， ZR含量在中低脅迫濃度下已開始出現(xiàn)促進(jìn)效應(yīng)，而GA<,3>含量仍為抑制效應(yīng)，因此推斷，杉木葉片內(nèi)的ZR可能比GA<,3>更早地修復(fù)脅迫對其代謝平衡的傷害作用。 5．杉木葉片蛋白質(zhì)組的雙向電泳技術(shù)優(yōu)化 杉木葉片蛋白質(zhì)主要分布在pH4-7范圍；裂解液中含有硫脲(2mmol/L)才

11、能較充分地溶解蛋白，DTI濃度60 mmol/L、上樣量1.5mg時(shí)得到的圖譜分辨率較好且蛋白斑點(diǎn)分布均勻、清晰，拖尾現(xiàn)象明顯減少，平衡液Ⅱ中碘代乙酰胺450 mg·15ml<'-1>時(shí)能提高圖譜分辨率；采用與質(zhì)譜兼容的考馬斯亮蘭進(jìn)行染色，得到近700個(gè)蛋白點(diǎn)。杉木葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的建立為開展逆境脅迫下杉木的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 6．鄰羥基苯甲酸脅迫下不同杉木無性系葉片差異表達(dá)蛋白的雙向電泳圖譜分析 運(yùn)用

12、Image Master 2D Platinum 6.0軟件對2個(gè)杉木無性系葉片總蛋白質(zhì)雙向電泳進(jìn)行圖譜分析。脅迫第1天時(shí)，01號檢測到12個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)表達(dá)蛋白6個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白4個(gè)，脅迫后新增蛋白點(diǎn)2個(gè)；02號檢測到2個(gè)差異蛋白，其中下調(diào)表達(dá)蛋白1個(gè)，脅迫后消失的蛋白1個(gè)。脅迫第3天時(shí)，01號檢測到7個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)表達(dá)蛋白1個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白5個(gè)，脅迫后消失的蛋白1個(gè)；02號檢測到2個(gè)差異蛋白，下調(diào)表達(dá)蛋白1個(gè)，脅迫后新增

13、的蛋白1個(gè)。脅迫第5天時(shí)，01號檢測到12個(gè)差異蛋白，上調(diào)表達(dá)蛋白4個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白3個(gè)，脅迫后消失的蛋白1個(gè)，脅迫后新增蛋白4個(gè)；02號只檢測到脅迫后新增蛋白1個(gè)?？梢娫卩徚u基苯甲酸脅迫下各無性系在不同時(shí)期差異表達(dá)的蛋白數(shù)量不同，01號杉木無性系基因調(diào)控體系活躍，對逆境脅迫信號響應(yīng)靈敏，當(dāng)外界傷害產(chǎn)生時(shí)能較快地調(diào)動(dòng)多個(gè)基因表達(dá)或關(guān)閉，使蛋白表達(dá)模式發(fā)生變化，有利于機(jī)體維持正常的生理活動(dòng)，以適應(yīng)或抵抗外界的傷害。 7．鄰羥基苯甲

14、酸脅迫下不同抗性杉木無性系葉片差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定及其生物學(xué)功能 利用MALDI-TOF-TOF/MS串聯(lián)質(zhì)譜和MASCOT軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和數(shù)據(jù)搜索，鑒定成功率為48％，鑒定成功的8種蛋白質(zhì)全部為01號無性系,02號無性系差異表達(dá)的蛋白均未得成功鑒定。鑒定成功的蛋白質(zhì)為：(1)放氧蛋白復(fù)合體33KD外周蛋白：與PSⅡ系統(tǒng)水的裂解和氧的釋放過程有關(guān)。(2)熱激蛋白：包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白Grp78和熱激蛋白Hsp cog

15、nate70、Hsp90，屬于分子伴侶，參與蛋白質(zhì)折疊、變性蛋白的復(fù)性與及降解、蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、遺傳物質(zhì)的復(fù)制轉(zhuǎn)錄與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)過程。(3)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)：參與了異常蛋白的降解及蛋白質(zhì)折疊的起始過程，對蛋白質(zhì)形成具有生物功能活性的空間結(jié)構(gòu)非常必要。(4)26S蛋白酶復(fù)合體(26S proeasome)：與泛素結(jié)合以降解錯(cuò)誤折疊或已被損壞的蛋白質(zhì)，阻止無功能的、具有潛在毒性的蛋白質(zhì)的集聚，從而介導(dǎo)生物的抗逆性，這

16、對于細(xì)胞抵抗逆境具有特殊的防御作用。(5)質(zhì)子移位膜ATP酶(F1 ATPase)：參與膜外質(zhì)子入胞或是逆向轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子于胞外，是細(xì)胞耐酸能力的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。(6)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：是植物光合和呼吸過程必不可少的的核心酶之一，在能量產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、微管排列及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能。(7)微管蛋白(Tublin)：微管蛋白與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂繁殖等生命活動(dòng)密切相關(guān)，對環(huán)境條