個體化組織工程骨修復(fù)長骨缺損實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、背景和目的： 日本骨科學(xué)會(JOA)自1985年起每5年就開展一次全國性的有關(guān)骨移植材料使用情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隨著現(xiàn)代醫(yī)療條件的改善，骨移植材料的使用每年都在增加，2007年最新一次發(fā)布的結(jié)果顯示2000年至2004年5年間的163，564例組織移植病例中82.4％為骨移植，其中植骨材料的選擇自體骨依然是首選，占56.4％；各種合成骨移植替代物占40％；骨庫同種異體骨僅占3.6％，但與前五年同期比較三者各自所占移植總量的比值卻表現(xiàn)

2、為自體骨移植所占比例不斷下降，人工骨移植比例持續(xù)上升，骨庫同種異體骨增速最快，三者平均每年較前年遞增倍數(shù)分別為1.32，1.68，和1.72倍1，故而部分專家建議對于小兒骨缺損修復(fù)則不再首選自體骨移植。其原因主要是考慮：自體骨移植局部效果雖好，但仍屬于“拆東墻補(bǔ)西墻”，且兒童青少年往往骨量有限，無法滿足大量植骨的需要，造成術(shù)中困難，對較大骨囊腫造成囊腔內(nèi)殘留死腔而致術(shù)后復(fù)發(fā)，而且取自體骨增加手術(shù)時間、費(fèi)用和感染幾率，造成取骨區(qū)疼痛，影響

3、兒童骨骼發(fā)育2。而親屬骨作為同種異體骨也并非臨床植骨的最優(yōu)選擇，且難以保證其確切的療效3。各國的研究者們曾經(jīng)嘗試采用多種人工替代材料修復(fù)這些骨缺損4，如各種人工合成材料、同種異體骨、人同種異體的脫鈣骨基質(zhì)等，雖然這些材料分別從某些特定的方面一定程度上彌補(bǔ)了自體骨植骨的缺點(diǎn)，但其固有缺陷決定了這些材料在骨需求量大，患者自身情況差時均不能較好地滿足臨床的需要及患者的要求。鑒于以組織工程骨修復(fù)大動物長骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究已取得了突破性的進(jìn)展5，有

4、必要在此工作基礎(chǔ)上謹(jǐn)慎地進(jìn)行一部分臨床試用性研究為今后組織工程骨正式走上臨床，形成對長骨缺損的正規(guī)化、規(guī)?；刂委熌Ｊ酵瓿膳R床觀察數(shù)據(jù)的初步積累，進(jìn)一步完善以組織工程骨修復(fù)長骨缺損治療及隨訪的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程6。然而目前我們所研制的組織工程骨構(gòu)建需要花費(fèi)較長的時間7且保存條件苛刻，不能達(dá)到“隨取隨用”的最終要求8。早期的研究發(fā)現(xiàn)，部分蛋白制品通過冷凍干燥技術(shù)處理后的真空包裝可以達(dá)到在室溫下保存2年而不發(fā)生變質(zhì)的良好效果9，從最早應(yīng)用于處理

5、生物學(xué)材料直到今天PhilipJ.等使用凍干同種異體骨成功修復(fù)牙周骨缺損10，凍干技術(shù)在骨組織保存方面的研究走過了近六十年的發(fā)展歷程，且還有研究表明，長期深低溫保存對于骨組織組織學(xué)以及力學(xué)性能的影響可以忽略不計11，這無疑為組織工程骨這種對成骨效能和力學(xué)強(qiáng)度同時均有較高要求的組織工程產(chǎn)品的保存乃至產(chǎn)業(yè)化指出了今后的發(fā)展方向。 此項研究的臨床試用是在獲得了第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行的，實(shí)施本項試用的西南醫(yī)院骨科已成為

6、全軍首家獲得總后勤部衛(wèi)生部批文的單位。 方法： 1.本課題按照組織工程骨修復(fù)長骨缺損臨床試用標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(SOP)為特定的患者于術(shù)前3-4周開始構(gòu)建個體化的組織工程骨，并在此過程中按規(guī)程中預(yù)定的檢驗(yàn)項目對構(gòu)建過程中的每個階段的目標(biāo)細(xì)胞或組織進(jìn)行嚴(yán)格的篩選和測定，始終信守首先保障受試者人身安全的承諾。 2.組織工程骨構(gòu)建成功后由指定醫(yī)師按照SOP中預(yù)定的臨床路徑展開對受試者圍手術(shù)期的各項診療、隨訪觀察和與受試者之

7、間進(jìn)行對其康復(fù)進(jìn)程的長期動態(tài)交流，以便及時發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的問題，給予受試者有益的建議和幫助。臨床療效評價主要通過對受試者影像學(xué)及血液學(xué)各項指標(biāo)的持續(xù)監(jiān)測進(jìn)行。 3.將當(dāng)天手術(shù)預(yù)留的組織工程骨同期植入6周齡BALB/C裸鼠皮下，通過對其定期行X線檢查、CT掃描以及取植入骨組織行切片、組織化學(xué)染色的方法評價植入骨的成骨情況，同時向裸鼠皮下注射與植入骨內(nèi)等量的種子細(xì)胞混懸液，通過觀察其生活習(xí)性有無改變及定期稱重、取其重要臟器行切片、HE

8、染色觀察的方法初步評價種子細(xì)胞的致瘤性。 4.將個體化的組織工程骨按標(biāo)準(zhǔn)程序凍干后與未凍干的組織工程骨一并提取其中的成骨相關(guān)蛋白后通過western-blotting技術(shù)對其中BMP-2、TGF-β1以及IGF-1的表達(dá)進(jìn)行測定，初步對個體化組織工程骨成骨機(jī)制和凍干對組織工程骨成骨能力的影響做一探索性研究。 結(jié)果： 1.按照組織工程骨臨床試用標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程構(gòu)建個體化工程骨的過程中，種子細(xì)胞增殖迅速，誘導(dǎo)分化效率高

9、，構(gòu)建的骨組織內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛，幾乎充滿支架材料的每個孔隙。 2.嚴(yán)格按照組織工程骨SOP成功完成了30例試用者所需組織工程骨的構(gòu)建，所有試用者手術(shù)過程順利并獲得了較完備的臨床隨訪資料。資料顯示腔隙性骨缺損植骨區(qū)于術(shù)后平均3月左右均可見較高密度的鈣化影，術(shù)后12月左右病灶獲得基本修復(fù)，CT檢查發(fā)現(xiàn)髓腔樣結(jié)構(gòu)。術(shù)后隨訪1.5年的病例可發(fā)現(xiàn)完全的髓腔再通，抽血檢查結(jié)果顯示各項指標(biāo)基本正常，符合術(shù)前對組織工程骨成骨效能較高且安全性良

10、好的預(yù)測。 3.裸鼠皮下異位成骨實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后1、2、3月復(fù)查X線片可觀察到植骨區(qū)逐漸出現(xiàn)高密度影的同時對照側(cè)DBM始終未顯影；術(shù)后3月組織學(xué)HE及Masson染色切片可觀察到組織塊內(nèi)部及外部均有編織骨形成，并有較多的成骨細(xì)胞及小血管長入；皮下注射種子細(xì)胞混懸液實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)裸鼠未見明顯生活習(xí)性改變，切取其心、肺、肝、腎做HE染色觀察未見組織破壞或腫瘤樣組織形成。 4.個體化組織工程骨內(nèi)BMP-2、TGF-β1以及IGF

11、-1三種抗體均呈陽性表達(dá)，細(xì)胞上架后電泳灰度值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均與上架前有顯著差異(P＜0.01)，表示細(xì)胞分泌蛋白量較未上架時有顯著意義的增加，同一樣本不同時間點(diǎn)電泳灰度值比較顯示上架第5、7、9天與上架3、12、15天相比較有顯著差異(P＜0.05)表示三種蛋白的表達(dá)高峰時段為上架后5-9天。 結(jié)論： 1.構(gòu)建的個體化組織工程骨用于臨床修復(fù)骨缺損未見明顯的排斥反應(yīng)，提示個體化的組織工程骨具有良好的組織相容性好和較為廣泛的

12、臨床應(yīng)用前景。動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用均觀察到體外構(gòu)建的組織工程骨具有良好的誘導(dǎo)成骨和促進(jìn)骨愈合作用。 2.通過對組織工程骨臨床試用者較長期的血清學(xué)持續(xù)監(jiān)測和放射學(xué)動態(tài)觀察，初步證實(shí)了組織工程骨用于修復(fù)各類長骨缺損有較強(qiáng)的生物安全性。 3.個體化的組織工程骨修復(fù)小兒長骨缺損顯示出了可喜的臨床效果，這為治療各種病因造成的小兒骨缺損的這一臨床難題提供了新的思路和方法。 4.根據(jù)我科制定并已提交SFDA討論審定的組織工程骨構(gòu)